明礬對HepG2、SMMC-7721肝癌細胞增殖的影響及機制探討

郝劍，吳雄志

(1天津醫科大學腫瘤醫院，天津300060;2國家腫瘤臨床醫學研究中心;3天津市“腫瘤防治”重點實驗室)

研究［1～3］發現，TGF-β1信號通路可抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡。在肝癌細胞中，TGF-β1/Smad信號通路可抑制肝癌細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡［4］。如果腫瘤細胞內 TGF-β1信號通路發生突變，其抑制作用將受到限制。因此，重新修復激活TGF-β1信號通路的抑制作用，成為腫瘤治療的新靶點。明礬主含含水硫酸鋁鉀，具有收濕斂瘡、止血化腐作用。現代研究發現，明礬可以控制燒傷創面綠膿桿菌感染，治療慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍、傳染性肝炎，并且其治療肝炎的作用機制與TGF-β1有關［5～15］。2014年2～10月，我們觀察了明礬對肝癌細胞增殖的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及藥物 人肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721(天津市腫瘤醫院實驗室)，用含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于5%、37℃條件下培養傳代。明礬購自北京鼎國生物技術有限責任公司。

1.2 肝癌細胞增殖檢測 選擇對數生長期HepG2、SMMC-7721細胞，以1×104/孔的濃度接種到24孔板，分別設置實驗組及對照組(HepG2細胞設為實驗1組和對照1組，SMMC-7721細胞設為實驗2組和對照2組)，實驗組細胞貼壁后分別加入50、100、150 μg/mL的明礬，對照組加入等體積的DMEM培養基，加藥后分別于 24、48、72、96、120、144、168 h終止反應，消化、收集細胞，在倒置顯微鏡下進行計數，并作出生長曲線。實驗組和對照組均設置3個復孔。

1.3 肝癌細胞周期及凋亡檢測 采用流式細胞儀。選擇對數生長期HepG2、SMMC-7721細胞，以5×104/孔的濃度接種到6孔板上，分別設置實驗組及對照組(HepG2細胞設為實驗1組和對照1組，SMMC-7721細胞設為實驗2組和對照2組)，實驗組細胞貼壁后加入100 μg/mL的明礬，對照組加入等體積的DMEM培養基，藥物處理96 h后，收集細胞制成單細胞懸液，按試劑盒(美國BD公司)說明書進行PI染色，檢測細胞周期。用AnnexinV-FITC/PI熒光染色，檢測細胞凋亡情況。

1.4 肝癌細胞 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 檢測采用RT-PCR法。選擇對數生長期HepG2、SMMC-7721細胞，以1×105/孔的濃度接種到6孔板上，分別設置實驗組及對照組(HepG2細胞設為實驗1組和對照1組，SMMC-7721細胞設為實驗2組和對照2組)，實驗組細胞貼壁后加入100 μg/mL的明礬，對照組加入等體積的DMEM培養基，藥物處理96 h后，提取細胞總RNA，取2 μg RNA逆轉錄合成cDNA鏈，并以1 μL cDNA作為模板，進行 RT-PCR。所用引物:TGF-β1:5＇-GGCCCTGCCCCTACATTT-3＇，5＇-CCGGGTTATGCTGGTTGTACA-3＇;p21WAF1/CiP 1:5＇-TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA-3＇，5＇-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAAT-3＇;bFGF:5＇-GATCCCGGGCGCTGCAGCTTG-3＇，5＇-GTTCACGGATGGGTGTCTCCGCG-3＇;Cyclin E:5＇-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3＇，5＇-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3＇;GAPDH:5＇-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3＇，5＇-CTGTTGCTGTA-GCCAAATTCGT-3＇。

1.5 肝癌細胞TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白檢測 采用ELISA法。選擇對數生長期HepG2、SMMC-7721細胞，以1×105/孔的濃度接種到6孔板上，分別設置實驗組及對照組(HepG2細胞設為實驗1組和對照1組，SMMC-7721細胞設為實驗2組和對照2組)，實驗組細胞貼壁后加入100 μg/mL的明礬，對照組加入等體積的DMEM培養基，藥物處理96 h后，裂解細胞提取蛋白，分別稀釋 10、100、1 000、10 000倍后按照ELISA試劑盒(達科為)說明書于490 nm酶標儀檢測蛋白含量，確定稀釋100倍時OD值大小最適宜。分別取稀釋100倍的蛋白裂解液檢測實驗組、對照組細胞內 TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白含量。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 100 μg/mL的明礬對 HepG2 細胞株在第 1、2、3、4、5、6 天的抑制率分別為 7.3%、1.3%、23.2%、53.7%、68.6%、97.3%，100 μg/mL的明礬對SMMC-7721細胞株在第1、2、3、4、5、6 天的抑制率分別為 3.6%、4.5%、14.1%、28.3%、47.2%、81.9%。明礬對肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721均有抑制作用，且抑制率具有時間和劑量依賴性(P均＜0.05)。

2.2 各組細胞周期、凋亡率比較 HepG2細胞:實驗1組及對照1組 G0/G1期細胞比例分別為73.15%、59.75%，兩組比較，P＜0.05;SMMC-7721細胞:實驗2組及對照2組G0/G1期細胞比例分別為76.66%、44.11%，兩組比較，P＜0.05。HepG2細胞:實驗1組及對照1組細胞凋亡率分別為22.53%、5.20%，兩組比較，P＜0.05;SMMC-7721細胞:實驗2組及對照2組細胞凋亡率分別為17.63%、4.80%，兩組比較，P ＜0.05。

2.3 各組細胞TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 表達比較 實驗1組 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 表達量分別為9.01±0.71、9.14±0.61、7.41±0.05，對照1組分別為8.23±0.24、8.46±0.13、8.41±0.11，兩組比較，P 均 ＜0.05;實驗 2 組 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA表達量分別為9.68±0.12、9.34±0.64、8.30±0.18，對照 2組分別為 7.84±0.12、8.23±0.12、8.65±0.35，兩組比較，P 均 ＜0.05。

2.4 各組細胞TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白表達比較 實驗1組 TGF-β1、p21、Cyclin E 蛋白表達量分別為(141.90±7.69)、(145.8±14.70)、(27.51±1.38)pg/mL，對照1組分別為(36.49±4.20)、(43.01±1.50)、(48.27±7.70)pg/mL，兩組比較，P 均 ＜0.05;實驗2 組 TGF-β1、p21、Cyclin E 蛋白表達分別為(178.50±17.77)、(201.40±18.65)、(24.18±3.44)pg/mL，對照2組分別為(43.15±1.77)、(41.01 ±0.64)、(45.60 ±3.91)pg/mL，兩組比較，P均＜0.05。

3 討論

肝癌是一種富含血管的實體性腫瘤，全世界每年約有75萬新發肝癌患者，并約有70萬患者死于肝癌。早期肝癌患者可進行手術治療或肝移植治療，但其復發率仍然很高，晚期肝癌患者缺少有效的治療方法。肝癌的發生涉及多種細胞因子和信號通路，目前針對分子靶點的靶向治療成為研究熱點［1］。

明礬是一種常見的中藥，主含含水硫酸鋁鉀，具有收濕斂瘡、止血化腐作用，外用能解毒殺蟲、燥濕止癢，內服可利膽、止血止瀉、祛除風痰［14］。在我國，明礬主要產于甘肅、安徽、山西、湖北、浙江等地［15］。現代醫學研究發現，明礬可以治療內痔、脫肛、子宮脫垂，對控制燒傷創面綠膿桿菌感染有效，亦可治療慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍、傳染性肝炎［5～15］。

TGF-β1信號通路作用復雜，在腫瘤早期其可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，發揮抑制腫瘤的作用［2，3］。在肝癌細胞中，以 TGF-β1處理肝癌細胞HepG2和Huh7，48 h后增殖細胞核抗原顯著下降，而Caspase-3、細胞色素C則明顯升高，并且IFNα2b可增強此效應，說明TGF-β1/Smad信號通路可抑制肝癌細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡［4］。但是，在腫瘤發生發展過程中，TGF-β1受體 TGFβR 的突變［16］以及TGF-β1信號通路突變［17］常導致腫瘤細胞對TGF-β1的抑制作用不敏感。研究［17］表示，37% ～70%的肝癌組織中存在TβRⅡ表達下降，酪氨酸激酶受體C可通過與TGFβRⅡ結合而抑制TGF-β1信號通路功能發揮，并促進腫瘤的發生、侵襲和轉移［18］，而 Smad2、4 發生基因突變［19～22］等亦可導致肝癌細胞內TGF-β1抑制信號通路的失活。因此，重新修復TGF-β1信號通路的抑制作用，是一種新的治療肝癌的方法。在明礬治療肝炎作用機制的研究中發現，其抑制肝細胞損傷和纖維化作用與TGF-β1相關。因此，我們推測明礬能夠激活修復TGF-β1信號通路，進而發揮抗腫瘤作用。本研究顯示，明礬能夠抑制肝癌細胞的增殖，并且呈時間和劑量依賴性，并且明礬能夠把肝癌細胞阻滯在G1期，并進一步促進細胞凋亡。

Cyclin E是G1期細胞周期素，是細胞從G1期向S期轉換的主要限速因素之一［23］。p21是細胞周期抑制蛋白Cip/Kip家族中的一員，是目前所知最廣泛的細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子之一，p21與 CDK2結合，通過競爭性抑制作用阻止Cyclin E、CDK2結合，抑制Cyclin E-CDK2復合物的活性，進而使Rb蛋白無法被磷酸化，從而不能釋放轉錄因子，而使細胞生長停滯于 G1期［24］。p21基因是TGF-β1信號通路的下游調節基因，在TGF-β1抑制腫瘤作用中發揮關鍵作用。在TGF-β1經典的Smad依賴性通路中，TGF-β1在 TβRⅢ輔助下，與TβRⅡ受體結合，TβRⅡ通過轉磷酸化作用磷酸化TβRⅠ，進一步促進Smad2、3，與Smad4結合后進入胞核，促進p21基因轉錄［3］。轉錄表達的p21蛋白通過抑制Cyclin E/A-CDK2復合體的形成，將細胞阻滯于G1期［18］。明礬作用于肝癌細胞株后，細胞內TGF-β1、p21表達增加，Cylin E 表達降低，說明明礬活化了肝癌細胞株的TGF-β1/Smad/p21通路，從而導致細胞阻滯在G1期，進而引起細胞凋亡。

總之，明礬能夠抑制肝癌細胞增殖，使肝癌細胞阻滯于G1期，并促進其凋亡，其機制可能與促進TGF-β1、p21表達及下調Cyclin E表達有關。

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