樹鼩遺傳多樣性的研究進展

楊香娣，曹驥，楊春

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021）

早期學(xué)者認為樹鼩在分類學(xué)上被視為攀鼩目，它是形似松鼠的一種小型哺乳動物。目前，攀鼩目一共包括筆尾樹鼩科和樹鼩科2科5屬。樹鼩科下有菲律賓樹鼩屬、細尾樹鼩屬、南印樹鼩屬和樹鼩屬4個屬，但筆尾樹鼩科只包含了筆尾樹鼩屬1個屬，也有人提出了該把菲律賓樹鼩屬歸類于樹鼩屬［1］。目前地理區(qū)域分布最廣的攀鼩目動物是中緬樹鼩。但由于國內(nèi)地理優(yōu)勢和樹鼩的分布特征，對樹鼩的研究在國內(nèi)偏多且處于領(lǐng)先地位，但現(xiàn)用于實驗的樹鼩多數(shù)來自野外或品系不純，對樹鼩群體的遺傳背景尚不太清楚，這使樹鼩在科學(xué)研究中的管理和應(yīng)用受到了極大的限制。因此，通過開展對樹鼩群體遺傳多樣性的研究，建立一個遺傳背景清晰明了的樹鼩品系十分重要。隨著研究和保護生物多樣性成為目前世界各地的關(guān)注熱點，物種遺傳多樣性的研究受到了越來越多的重視。通常說到的遺傳多樣性是指種群之間和種群內(nèi)不同個體間的遺傳變異總和。研究某一物種的遺傳多樣性不但可以了解到其群體遺傳結(jié)構(gòu)與多態(tài)性差異，同時也為物種分類、充分利用與保護已有的種質(zhì)資源提供重要的依據(jù)。遺傳多樣性的研究主要包括表型、染色體、蛋白質(zhì)及DNA水平等方面的內(nèi)容。現(xiàn)將目前國內(nèi)外對樹鼩遺傳多樣性在各水平的研究動態(tài)綜述如下，以期為樹鼩的合理利用和遺傳育種提供更多的依據(jù)。

1 表型多樣性

基于表觀形態(tài)特征的研究是遺傳多樣性研究最直接和原始的方法，然而由于樹鼩的表型多樣化，目前國內(nèi)外學(xué)者對樹鼩的分類方法并不一致。王應(yīng)祥［2］通過標本采集等方法研究了中緬樹鼩不同亞種之間的表型水平差異，發(fā)現(xiàn)在體型大小、體質(zhì)量大小、尾長等方面存在不同特征，進一步說明樹鼩種內(nèi)遺傳變異是多樣的，不同性狀在不同水平上的變異程度也不同。Wu等［3］通過測量昆明近郊樹鼩的體質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，同一種群內(nèi)4～12月齡樹鼩雄性個體體質(zhì)量顯著高于雌性個體，且隨著月齡的增加，這種性別之間的差異會逐漸減小。李波等［4］通過對樹鼩解剖發(fā)現(xiàn)，7～9個月齡雌、雄樹鼩在心、肺、左海馬、右腎、左右甲狀腺、左頜下腺、左腎上、小腸、腺膀胱、右海馬重量及系數(shù)都有較明顯差異;而右頜下腺、脾及左腎僅重量有明顯差異，無系數(shù)大小差異;胃、腦、大腸、右腎上腺系數(shù)有差異，但重量上無差異。于永梅等［5］通過對人工繁殖條件下的35只中緬樹鼩主要外貌特征研究，發(fā)現(xiàn)中緬樹鼩典型的外貌特征是野生型，毛色有季節(jié)性紅斑、沒有白眼圈、白腹、耳朵不豎、尾尖呈圓形、掌底膚色為肉色、兩側(cè)乳房每對之間的連線都分別與體軸線垂直。也有學(xué)者通過對分布于云南、廣西和貴州地區(qū)190個中緬樹鼩的頭骨和32顆臼齒的形態(tài)特征進行初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)他們的形變多集中在臼齒和鼻骨，這可能與中緬樹鼩棲息的地理環(huán)境和氣候有關(guān)［6］。上述研究結(jié)果說明，不同地區(qū)樹鼩群體之間存在顯著差異，通過樹鼩表型多態(tài)性能簡便、易行、快速區(qū)別種屬甚至亞種，但目前研究的實驗樹鼩大多來自野生群體，表型特征差異不一定都是遺傳變異的真實反映，而且受到外界環(huán)境、生活習(xí)性等多重因素的影響，因此建立一個遺傳背景清晰的樹鼩品系還必須結(jié)合其他的標記技術(shù)，進行更深層次的研究。

2 染色體多樣性

作為遺傳物質(zhì)載體與基因攜帶者，染色體變異可引起遺傳變異的發(fā)生。劉瑞清等［7］比較了中國西南部樹鼩的三個亞種染色體特征，結(jié)果顯示越北亞種、滇西亞種、瑤山亞種的染色體數(shù)目都是62，且G帶與C帶基本相似;核仁銀染區(qū)的數(shù)目也相同（4～6個），且分布相似。研究表明，三個亞種都為二倍體，亞種之間核型基本上相同，從而為樹鼩的分類鑒定提供了細胞遺傳學(xué)依據(jù)。我們知道染色體水平上的研究不易受到環(huán)境的影響，但是目前染色體的細胞學(xué)標記數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異都非常有限，從而限制了這一技術(shù)方法在亞種分類中的應(yīng)用。

3 蛋白質(zhì)多樣性

蛋白質(zhì)相對復(fù)雜，而且研究方法相對有限，因此關(guān)于樹鼩蛋白質(zhì)多樣性的研究也相對較少，主要是集中在對其血液成分和同工酶等方面的研究。酶是基因表達的產(chǎn)物，其多肽鏈中的氨基酸序列多由結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列決定，同工酶的產(chǎn)生主要是由于構(gòu)成酶蛋白亞基的氨基酸組成和順序不同所導(dǎo)致的。同工酶普遍存在于生物界，并呈共顯性，通過電泳技術(shù)測定的方法簡易、獲得結(jié)果迅速，因此研究起來相對方便。季維智等［8］利用同功酶丙烯酰胺圓盤電泳技術(shù)，通過對云南昆明、瑤山和廣西南寧地區(qū)樹鼩的乳酸脫氫酶（LDH）同功酶和種群的關(guān)系進行了研究，結(jié)果提示不同地域的樹鼩LDH同功酶酶譜表現(xiàn)出一定的差異，這與王應(yīng)祥等對樹鼩形態(tài)學(xué)分類的研究結(jié)果一致，即昆明、南寧和瑤山樹鼩應(yīng)為三個不同的亞種。雖然同工酶具有相對穩(wěn)定性，但是多數(shù)情況下同工酶水平研究的可靠性均較DNA水平研究低，并且同工酶具有組織特異性，易受發(fā)育階段的影響。

4 基因多樣性

作為遺傳多樣性的本質(zhì)，基因多態(tài)性是最直接、最可靠的多態(tài)性，它包括了染色體多態(tài)性和線粒體DNA（mtDNA）多態(tài)性。因此，基因多態(tài)性研究主要為核DNA多態(tài)性和mtDNA多態(tài)性研究。雖然基因信息量大，但研究方法相比蛋白來說具有更多的選擇性，如常用的有直接測序，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性、微衛(wèi)星DNA標記、單核苷酸多態(tài)性（SNP）標記、隨機擴增多態(tài)性標記等方法。如楊芳等［9］通過對30 只中緬樹鼩的 Car2、Es3、Akp1、Trf、Ce2、Es1 等 6個酶基因位點進行檢測及計算分析，了解樹鼩遺傳多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn) Car2、Es3位點無遺傳多態(tài)性，而Es1、Akp1、Trf、Ce2 位點具有遺傳多態(tài)性，并且多態(tài)性較高。雖然目前關(guān)于基因多態(tài)性的研究方法比較多，但現(xiàn)在比較成熟及常用的方法主要有微衛(wèi)星DNA標記、SNP標記、隨機擴增多態(tài)性標記等技術(shù)，且都是表現(xiàn)出染色體DNA中核苷酸的排列順序變化［10］。

4.1 微衛(wèi)星DNA多態(tài)性 微衛(wèi)星DNA又稱簡單重復(fù)序列，廣泛存在于真核基因組中，指的是在DNA基因組中比10個核苷酸小的簡單重復(fù)序列。目前，對樹鼩的基礎(chǔ)生物學(xué)方面研究相對比較滯后，對整個基因組上微衛(wèi)星位點的分布和遺傳特征尚沒有一個系統(tǒng)性的研究和認識。Srikwan等以普通樹鼩為對象，利用微衛(wèi)星技術(shù)篩選出了6個微衛(wèi)星位點，并對野生樹鼩的種群內(nèi)多樣性以及種群間的關(guān)系進行了研究。隨后，Munshi-South等［11］也篩選出5個微衛(wèi)星位點，并研究了其遺傳多樣性。何保麗等［12］利用PCR擴增技術(shù)對30只中緬樹鼩個體的11個微衛(wèi)星位點進行了遺傳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其等位基因數(shù)為2～12個不等，雜合度為0.242～0.801，每個位點的多態(tài)信息含量范圍為0.198～0.699，平均多態(tài)信息為0.518，這在一定程度上說明了在同一地緣和同一種群中，個體間也存在著DNA多態(tài)性。然而，這些研究中所使用的技術(shù)方法可能對于識別檢測到的微衛(wèi)星位點多態(tài)性存在著一定的判讀誤差。為此，Liu等［13］對中緬樹鼩20個多態(tài)性的微衛(wèi)星基因座擴增，其中只有14個能夠成功擴增，有6個未能擴增出來或者是條帶非特異，隨后便對這成功擴增的14個基因進行測序?qū)Ρ龋l(fā)現(xiàn)TB9和TB14的重復(fù)序列都有一定程度的突變，即AAG變成了GAG。然后再用這14個微衛(wèi)星基因座對117只中緬樹鼩檢測，發(fā)現(xiàn)TB2和TB10無多態(tài)性，而剩下的12個基因座不僅具有多態(tài)性，同時也表現(xiàn)出較高的期望雜合度，這提示我們在培育純化樹鼩品系時，種群內(nèi)的個體基因多態(tài)性是不能忽略的因素。雖然目前對中緬樹鼩開展了一些研究，但針對亞種、各地理群體間遺傳多態(tài)性的比較系統(tǒng)的研究尚缺乏，這將極大地限制對樹鼩遺傳資源的保護和利用，也是今后科研工作中的難點和重點。

4.2 隨機擴增長度多態(tài)性（RAPD）RAPD DNA標記也可作為遺傳標記用于樹鼩遺傳多樣性的研究。RAPD具有DNA用量少、技術(shù)簡單、不需探針、多態(tài)性識別率較高、安全性較好等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性的研究［14］。黎嘉敏等［15］先從 40條隨機引物挑選出了20條重復(fù)性好和特異性較強的RAPD引物，對從昆明郊區(qū)野外捕捉的成年中緬樹鼩進行PCR擴增，結(jié)果檢測到的多態(tài)位點有69個，多態(tài)位點比率達到61.1%。個體間遺傳距離范圍在0.09 ～0.27，遺傳距離平均為 0.169 3，這提示個體之間遺傳差異較大，進一步分析發(fā)現(xiàn)有48.29%多態(tài)性位點來源于群體內(nèi)，51.71%來源于雌雄群體間。研究表明，所篩選的隨機引物可有效地用于分析中緬樹鼩種群的遺傳結(jié)構(gòu)，這對于樹鼩種群的保護、利用和選擇育種以及實現(xiàn)樹鼩實驗動物標準化具有十分重要的意義。

4.3 mtDNA多態(tài)性 mtDNA是存在于胞內(nèi)線粒體中的一種遺傳物質(zhì)。mtDNA因具有高拷貝、母系遺傳的特點，從而被廣泛應(yīng)用在群體遺傳學(xué)和法醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域［16］。陳仕毅等［17］分析了80只源于云南昆明周邊地區(qū)的野生樹鼩mtDNA多態(tài)性，并結(jié)合國外報道的2個樹鼩序列比對，發(fā)現(xiàn)其具有較高的群體遺傳多樣性。此外，還發(fā)現(xiàn)了昆明地區(qū)的樹鼩和國外所報道的2個樹鼩間存在較大的遺傳分化。研究結(jié)果提示，基于昆明地區(qū)樹鼩與國外樹鼩之間存在著較大遺傳差異，說明mtDNA的研究可以用于對樹鼩種群遺傳多樣性的分析。隨后朱萬龍等［18］通過測定祿勸、劍川、麗江3個地區(qū)種群的線粒體Cytb基因的全序列與控制區(qū)D-loop基因區(qū)段，對Cytb基因的檢測發(fā)現(xiàn)了47個多態(tài)性位點，其中有24個簡約信息位點，23個單變異位點，進一步分析發(fā)現(xiàn)祿勸、劍川、麗江3個地域的中緬樹鼩種群內(nèi)遺傳距離分別是0～1.7%、0 ～1.2%、0 ～1.1%;而這3 個地區(qū)樹鼩種群間的遺傳距離分別是0.1% ～1.9%（祿勸—麗江）、0.1% ～1.9%（祿勸—劍川）、0 ～1.2%（劍川—麗江）。對D-loop基因檢測發(fā)現(xiàn)有21個多態(tài)性位點，其中簡約信息位點和單變異位點分別有11、10個，種群內(nèi)遺傳距離分別是 0 ～1.1%（祿勸）、0.3% ～1.4%（麗江）;樹鼩種群間的遺傳距離分別是0.3% ～1.4%（祿勸—麗江）、0.5% ～1.2%（祿勸—劍川）、0.1% ～1.1%（劍川—麗江）。進一步數(shù)據(jù)分析得出，3個地區(qū)的中緬樹鼩明顯可分為兩支，一支全是祿勸種群，另一支基本上是劍川—麗江種群（除1個為祿勸單倍型）。此外，通過進化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系推測祿勸種群更接近祖先種，而橫斷山種群（劍川、麗江種群）可能是祿勸種群改變而來，且因橫斷山地區(qū)特殊的生態(tài)環(huán)境使其擁有的遺傳多樣性更高，實驗結(jié)果同時提示中緬樹鼩可能出現(xiàn)由南向北的擴散模式。

上述DNA分子標記都是以個體間核苷酸序列差異為基礎(chǔ)的遺傳標記。DNA多樣性研究具有數(shù)量多、高度多態(tài)、呈共顯性遺傳等優(yōu)點，但是目前尚沒有一種DNA分子標記技術(shù)是令人十分滿意的，仍需要進一步地探索出重復(fù)性好、可靠性高、操作簡易的分子標記技術(shù)［19］。

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