一種簡便的皮層神經元原代培養方法的建立及其培養結果分析

唐仕軍，趙冬，朱立倉，李曉天，朱文學，楊鵬，王業忠

(1石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子832000；2石河子大學醫學院)

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一種簡便的皮層神經元原代培養方法的建立及其培養結果分析

唐仕軍1,2，趙冬1，朱立倉1，李曉天1,2，朱文學1,2，楊鵬1,2，王業忠1

(1石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子832000；2石河子大學醫學院)

摘要：目的建立一種簡便的皮層神經元原代培養方法，并鑒定其培養效果。方法取出生24 h內的SD大鼠大腦皮層組織，采用胰酶消化法獲取神經元細胞懸液，用10% FBS+DMEM高糖培養基接種在經多聚賴氨酸包被的培養板中，4 h后全量換用Neurobasal+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺培養液。培養后采用倒置相差顯微鏡觀察神經元形態變化，連續觀察8天。神經元培養7～8天進行免疫熒光染色，于激光共聚焦顯微鏡下對神經元進行鑒定，計算神經元密度和純度。結果皮層神經元接種時體積小，透亮，呈圓形，單個散在分布。接種后有少量細胞開始貼壁，2 h左右貼壁較多，少量細胞伸出短小的突起；4 h左右已基本貼壁，大量細胞伸出突起，周圍光暈明顯；培養3天時神經元突起明顯伸長，相互交織，細胞透亮，立體感強，呈圓形、橢圓形、梭形；培養5～6天時神經元體積增大，突起交織成網狀；培養7～8天時，神經元細胞體飽滿，細胞質透亮，細胞核大而明顯，細胞體周圍折光性強，立體感好，突起交織成致密的網絡結構。經免疫熒光染色后鑒定，分離培養的是神經元，密度1.5×106個/mL，純度>90%。結論成功建立了一種操作簡便的皮層神經元培養方法，該方法培養的神經元純度高、密度大，可為今后的相關學科研究提供良好的細胞模型。

關鍵詞：皮層神經元；原代培養；Neurobasal；B27；細胞模型；新生大鼠

神經元具有高度分化、很少分裂的特點，從神經突起到成熟神經組織分離出神經元的過程中，神經元會受到不同程度的損傷，因此神經元體外原代培養是一項對實驗要求較高、難度較大的培養技術。目前神經元原代培養方法很多，傳統方法取材于胎鼠，主要是因為胎鼠胚胎時期神經元分化程度較低，體外生存能力強，取材中造成的不可逆損傷較小，便于成功培養；但胎鼠腦體積小，取材較為困難，且胎齡不易確定，故用新生鼠代替胎鼠進行原代培養已逐步被認可。出生24 h以內的新生鼠神經系統發育基本完成，很多神經元已長出突起，但是取材于該時期的腦組織對神經元的損傷較大，神經元死亡率較高，培養難度較大。2014年8月～2015年8月，我們在以往神經元培養方法[1～5]的基礎上經過反復試驗，對先前的培養方法加以改進，建立了一種簡便的神經元原代培養方法。現報告如下。

1材料

出生24 h內的SD大鼠8只，雌雄不限，體質量約7 g，購于新疆醫科大學實驗動物中心。DEME高糖培養基、10% FBS購于上海聯碩生物科技有限公司，Neurobasal、B27、青霉素和鏈霉素(10 000 U/mL)、L-谷氨酰胺、0.25%胰酶購于美國GIBCO公司，神經元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體購于英國ABCAM公司，L-多聚賴氨酸(PLL，1 mg/mL)、PBS購于上海生工生物工程有限公司。

2皮層神經元原代培養方法

2.1培養基制備接種培養基：DMEM高糖培養基+10% FBS+雙抗(青霉素和鏈霉素，100 U/mL)。基礎培養基：Neurobasal+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺+雙抗(青霉素和鏈霉素，100 U/mL)，4 ℃冰箱保存備用。

2.2培養皿預處理細胞培養前2～3天，對細胞培養的所有器皿進行預處理：對手術器械及槍頭進行高壓蒸汽滅菌30 min后，烘箱烘干備用；玻璃蓋片先經自來水沖洗干凈，烘箱烘干，再經濃硫酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈；再用雙蒸水沖洗3遍，無水乙醇浸泡后，在超凈臺下酒精燈過火待全部乙醇蒸發。用尖鑷夾取玻璃蓋片放入6孔板內，每孔1張，加入1～2 mL PLL，37 ℃細胞恒溫培養箱放置過夜。細胞培養前2 h，將6孔板內的PLL吸盡，PBS沖洗3次，吸盡PBS，放置于恒溫培養箱內晾干備用。

2.3皮層神經元原代培養取出生24 h內的新生SD大鼠，在盛有75%乙醇的燒杯中清洗2次，每次1 min。在超凈臺下迅速斷頭取腦，置入預冷的玻璃皿中。左手持鑷固定新生鼠頭部，右手持眼科剪沿矢狀縫剪開顱骨，用一把長鑷剝除頭皮及顱骨，充分暴露大腦皮層。用眼科鑷在顯微鏡下小心剝離皮層的腦膜和血管，換用另一把眼科鑷小心取下皮層組織，移入到預先加入1 mL DMEM高糖培養基的培養皿中，培養皿置于冰上。用眼科剪將皮層組織剪成約1 mm×1 mm的組織碎塊，在培養皿中再加1 mL DMEM高糖培養基及2 mL 0.25%胰酶，在37 ℃細胞恒溫培養箱中消化。培養5 min時輕輕搖晃培養皿，15 min時取出培養皿，將組織塊吸入到提前預冷的離心管中，加入含10%FBS的DMEM高糖培養基2 mL終止消化。用1 mL進口槍頭輕輕吹打未完全消化的組織塊，待組織塊完全吹散后，將吹打后的細胞懸液用200目篩網過濾，4 ℃離心(1 000 r/min)5 min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM高糖培養基2 mL重懸細胞。待細胞成為懸液后，取10 μL細胞懸液加入到90 μL含10%FBS的DMEM高糖培養基，充分混勻。再加入等量臺盼藍染色，置于計數板上，倒置相差顯微鏡下計算細胞密度，以≥1×106個/mL密度接種到提前包被有PLL的6孔板中，每孔加入2 mL含10%FBS的DMEM高糖培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，4 h后用Neurobasal+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺培養液全量換液1次，以后每3天進行半量換液。

3皮層神經元鑒定

3.1鏡下形態學觀察神經元接種培養后，在倒置相差顯微鏡下觀察皮層神經元形態學變化，連續觀察8天。皮層神經元接種時體積小，透亮，呈圓形，單個散在分布。接種后有少量細胞開始貼壁，2 h左右貼壁較多，少量細胞伸出短小的突起；4 h左右已基本貼壁，大量細胞伸出突起，周圍光暈明顯。培養3天時神經元突起明顯伸長，相互交織，細胞透亮，立體感強，呈圓形、橢圓形、梭形。培養5～6天時神經元體積增大，突起交織成網狀。培養7～8天時，神經元細胞體飽滿，細胞質透亮，細胞核大而明顯，細胞體周圍折光性強，立體感好，突起交織成致密的網絡結構。見插頁圖1。

3.2免疫熒光染色觀察神經元培養7～8天，以抗NSE抗體為一抗，進行免疫熒光染色后對神經元進行鑒定：0.01%預冷的PBS浸洗細胞爬片2次，吸盡PBS；4%多聚甲醛固定5 min，PBS浸洗2次，每次5 min。3%雙氧水封閉30 min，消除內源性過氧化物酶活性；PBS浸洗3次，每次5 min。山羊血清封閉30 min，加入NSE 一抗(1∶500)，4 ℃冰箱孵育過夜(約12 h)，PBS浸洗3次，每次5 min；加入二抗。避光孵育60 min后PBS浸洗3次，每次5 min；滴加PI染液(1∶1 000)100 μL，30 s后PBS浸洗2次，每次2 min，甘油(約30 mL)封片。激光共聚焦顯微鏡下取6個視野拍照，觀察神經元形態，計算神經元密度；計數細胞總數，以熒光陽性細胞為神經元，純度=神經元數/細胞總數×100%。細胞經NSE和PI免疫熒光雙標染色后呈強陽性，激光共聚焦顯微鏡下觀察，細胞質和突起被染成綠色、胞核被染成紅色的為神經元，細胞核被染成紅色而細胞質無染色的為非神經元，見插頁圖2。神經元密度為1.5×106個/mL，純度>90%。

4討論

體外培養的皮層神經元為一種廣泛應用的細胞模型，可為研究腦血管病、神經系統疾病的發病機制及其治療提供試驗基礎[6～9]。本課題組通過反復的試驗，結合自身試驗條件及以往細胞培養方法，建立了一種操作簡單、細胞性質穩定、純度較高的皮層神經元原代培養方法。現將經驗總結如下。

4.1取材對象的選擇目前神經元原代培養多采用新生鼠代替乳鼠，新生鼠的出生時間多選擇在24 h以內，超過24 h的新生鼠皮層神經元雖然可以培養成活，但其中神經膠質細胞含量較多，抑制神經元的生長，甚至會導致神經元死亡[10,11],故本研究選用出生12 h以內的新生鼠，以提高神經元原代培養的成活率。

4.2培養基的選擇神經元培養基主要有血清培養基和無血清培養基兩種。用含10% FBS的DMEM高糖培養基為神經元提供生長所必需的營養成分，促進細胞的增殖。但神經元培養基也能為神經膠質細胞提供豐富的營養，在細胞貼壁后神經膠質細胞開始分裂生長，到12 h時開始大量分裂，抑制神經元生長。因此，在細胞接種時選擇含10% FBS的DMEM高糖培養基，細胞接種后4 h時，神經元已基本貼壁，換用神經元專用培養基Neurobasal。Neurobasal可抑制非神經元的增殖，使神經元保持較好的細胞活性及生理特性[12,13],為神經元提供生長所需的營養物質。此外，Neurobasal中加入2% B27，可抑制膠質細胞有絲分裂，促進神經元的生長，使神經元保持較好的活性，從而提高其純度。

4.3培養皿的處理神經元較其他細胞難以在體外存活和生長。本課題組經過多次試驗發現，當細胞接種到未經PLL包被的培養皿后，細胞貼壁較慢，貼壁數量較少，大量細胞集聚成團懸浮在培養基中，且隨著時間的推移，懸浮細胞大量死亡。而使用經PLL包被的培養皿，細胞接種后有少量細胞貼壁，2 h左右細胞貼壁較多，4 h左右已貼壁完全，神經元生長良好。因此，細胞接種前需用PLL包被培養皿，促進神經元的黏附及其貼壁生長。

4.4皮層神經元的提取皮層神經元的提取是培養成功的難點及關鍵步驟。首先要確保新生鼠是在出生24 h以內；其次在暴露新生鼠大腦皮層時應先用一把眼科鑷沿大腦邊緣由外向內小心徹底地將腦膜和血管剝除，剝除腦膜和血管的過程中，注意保持大腦皮層的干凈和完整，然后換用另外一把無菌眼科鑷夾取大腦皮層表面一薄層，并迅速置入培養基中。取樣不可太厚，否則神經膠質細胞較多。整個過程中可將兩把眼科鑷置入預冷的DMEM高糖培養基中，一是為了清洗眼科鑷上殘留的組織，二是為了保持眼科鑷的潤滑度，便于提取皮層組織，提高細胞純度，減少雜質。既往神經元培養在取材時，斷頭取腦后多采用PBS或D-Hank′s將血反復漂洗干凈，然后再剝除皮膚及顱骨暴露雙側大腦半球，取出大腦半球置于顯微鏡下剝除腦膜和血管，其操作過程復雜，操作時間相對較長。本方法改進之處在于：①新生鼠經酒精消毒后，迅速斷頭取腦，快速剪開顱骨、剝除顱骨及頭皮，充分暴露大腦皮層后，用兩把不同的眼科鑷分別取材，省去了漂洗的步驟，方法簡便易行，為后續操作節省了時間；②用于取材的兩把眼科鑷分別置于預冷的培養基中，其中一把用于剝除腦膜和血管，另一把用于夾取大腦皮層組織，既避免了雜質污染，又便于皮層組織的提取，可進一步提高神經元的純度。

4.5皮層組織消化將1 mL DMEM高糖培養基和2 mL 0.25%的胰酶混合，使胰酶稀釋比例為0.125%。將組織塊放入胰酶中進行消化，時間控制在15 min左右。5 min左右時晃動培養皿1次，使其充分混勻。若皮層組織較多，為使組織消化完全，可適當等比例增加DMEM高糖培養基和胰酶的用量。

4.6神經元接種接種密度影響神經元的生長。接種密度低時，神經元分布稀疏，聯系減少，突觸伸展較慢，神經元生長緩慢，而神經膠質細胞分裂明顯；接種密度大時，神經元分布緊密，聯系增多，突觸增粗增長，相互交織成網狀結構，可抑制非神經元生長。本研究神經元接種密度1×106個/mL。在細胞接種時，需將細胞懸液輕輕吹打，使神經元成為單個的細胞。吹打過程中動作要輕柔，不能有氣泡，計數板計數后，均勻地接種在培養板中。接種后需按前后、左右、左上右下、右上左下方向搖勻細胞，細胞接種不均勻會使神經元成堆集中在培養板中央，細胞貼壁后由于擁擠致細胞大量死亡。

4.7B27的應用B27含有神經元生長所必需的多種生長因子和微量元素，一方面可以保證神經元生長所需的營養，另一方面可抑制神經膠質細胞的增殖，以提高神經元的純度[14,15]。

總之，本研究建立的皮層神經元培養方法操作簡便，其培養的神經元純度高、密度大，可為今后的相關研究提供良好的細胞模型。

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胎牛血清(FBS)三磷酸腺苷(ATP)天冬氨酸轉氨酶(AST)

丙氨酸轉氨酶(ALT) 人類免疫缺陷病毒(HIV) 獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)

甲型肝炎病毒(HAV) 乙型肝炎病毒(HBV) 丙型肝炎病毒(HCV)

甘油三酯(TG) 總膽固醇(TC) 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)

高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 核因子-κB(NF-κB) 磷酸鹽緩沖液(PBS)

Establishment of a simple and convenient method for primary culture of cortical neurons

and identification of culture results

TANGShi-jun1,ZHAODong,ZHULi-cang,LIXiao-tian,ZHUWen-xue,YANGPeng,WANGYe-zhong

(1TheFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversityMedicalCollege,Shihezi832000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a simple and convenient method for primary culture and to identify its validity. MethodsThe cortical tissues of SD rats born within 24 h were collected, and we got the neuronal cell suspension by trypsin digestion, explanted onto poly-L-lysine-coated plates with DMEM +HG + 10% FBS culture medium for 4 h, then the medium was replaced with neuronal culture medium with Neurobasal 2% B27+0.5 mmol/L glutamine. We observed the neuronal morphological changes for 8 days through inverted phase contrast microscope. Under the laser scanning confocal microscopy, neurons were cultured for 7 to 8 days, and the cells were identified by immunofluorescence staining. The density and purity of neurons were calculated. ResultsWhen the cortex neurons were inoculated, they were small, bright, translucent, round, and scattered in the distribution. After inoculation, a small amount of cells adhered to the wall, 2 hours later, more cells adhered to the wall, and a few cells produced short neurites; 4 hours later, most cells adhered to the wall, and a large number of cells produced neurites around the halo. After 3 days of cluture, the neurites were elongated, intertwined, transparent, and had strong three-dimensional sense with the round, oval and fusiform shapes. After 5 to 6 days, the cell bodies of the neurons increased, and the processes of the neurons wove into a network. After 7 to 8 days, the body of neuronal cell was full, cytoplasm was translucent, nucleus was large and obvious, the cell body had strong refraction, three-dimensional sense was good, and the processes wove into a network structure. The neuron density was 1.5×106/mL and the purity was more than 90%. ConclusionA simple and convenient method for primary culture was established with high purity and high density, which can provide a good cell model for the related scientific research.

Key words:neurons; primary culture; Neurobasal; B27; cell model; newborn rats

收稿日期：(2015-10-13)

中圖分類號：R329.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)48-0019-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.006

通信作者簡介：王業忠(1967-)，男，主任醫師，研究方向為腦血管疾病及顱內腫瘤等。E-mail: wangyz2008@126.com

作者簡介：第一唐仕軍(1987-)，男，碩士，研究方向為腦血管疾病基礎與臨床。E-mail: 396112963@qq.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81360185)；新疆生產建設兵團博士基金資助項目(2011BB016)。