大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區TREK-1、GFAP表達變化

大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區TREK-1、GFAP表達變化

袁建清，廖春英，黃櫻

(贛南醫學院第一附屬醫院，江西贛州 341000)

摘要：目的觀察新型雙孔鉀離子通道亞單元TREK-1及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)在大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區的表達變化。方法建立大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)再灌注模型，應用免疫熒光組化和激光掃描共聚焦觀察正常大鼠及MCAO 再灌注后3、7、30天海馬CA1區TREK-1和GFAP表達情況，同時應用Western blotting法檢測大鼠MCAO 再灌注后3、7、30天海馬CA1區TREK-1、GFAP蛋白表達。結果成年大鼠海馬CA1區可見TREK-1和GFAP雙標陽性的細胞，而未見有TREK-1和NEUN雙標陽性的細胞；MCAO 再灌注后3、7、30天海馬CA1區TREK-1和GFAP表達逐步上調，與正常大鼠比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。結論 大鼠局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區TREK-1、GFAP表達均升高。

關鍵詞：腦缺血；海馬；TREK-1；鉀離子通道；膠質纖維酸性蛋白；星形膠質細胞

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.014

中圖分類號：R743.31 文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-08-11)

通信作者：黃櫻

星形膠質細胞在腦缺血病理過程中起重要作用，在缺血后不同時程，增殖活化不同，有保護或加重神經元損傷的功能[1，2]。研究[3～5]表明，TREK-1通道可能參與了腦缺血后星形膠質細胞神經保護作用，雙孔鉀通道TREK-1表達于成熟星形膠質細胞，介導線性I-V關系的背景K離子電流和低的膜電位，有助于調控水及離子動態平衡、清除興奮性毒性物質、氧自由基，發揮神經保護作用。大鼠腦缺血后海馬TREK-1表達情況及與星形膠質細胞活化、增殖的關系國內外尚少見報道。2013年5月，我們觀察了大腦中動脈缺血再灌注模型(MCAO)腦缺血再灌注后大鼠海馬CA1區TREK-1及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達變化，探討TREK-1與星形膠質細胞活化的關系，為探索腦缺血治療的新的作用靶點提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料成年(3月齡)健康雄性Wistar大鼠48只，體質量250～300 g，由贛南醫學院動物實驗中心提供。兔抗TREK-1購于以色列Alomone Labs公司，小鼠抗NEUN購于美國Chemicon公司，小鼠抗膠質纖維酸性蛋白(GFAP)購于美國Neomarkers公司，異硫氰酸熒光素( FITC) 標記的羊抗小鼠IgG和花青素(Cy3) 標記的驢抗兔IgG購于美國Jackson ImmunoResearch公司。普通小牛血清、普通羊血清和普通驢血清購于美國Jackson ImmunoResearch公司，Cocktail (蛋白酶抑制合劑)購于美國Sigma公司，ECL顯色試劑盒購于美國Pierce公司。恒冷切片機(德國Leica公司CM1900型)，激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司FV500型)，臺式低溫離心機(德國Eppendorf公司5804R型)，電泳儀(美國Bio-Rid公司)，凝膠成像分析系統(美國Gene Genius公司)。

1.2MCAO制備及分組應用線栓法[6,7]建立MCAO模型。將實驗大鼠隨機分為4組，分別為假手術(sham)組、MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 30 d組，每組12只，6只用于免疫組化檢測，6只用于Western blotting檢測。術前12 h禁食，自由進水。用6%水合氯醛麻醉(300 mg/kg體質量)，術中維持動物直腸溫度(36.6±0.5)℃。分離并結扎右側頸總動脈、頸外動脈，注意避免刺激迷走神經。于頸總動脈近頸內動脈、頸外動脈分叉處剪一小口，插入一前端5 mm涂以硅膠的4-0絲線進入頸內動脈，深度為距離頸總動脈分叉處1.8～2.0 cm，1 h后拔出絲線進行再灌注。按Longa等[7]神經功能評分1～3分者入選MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 30 d組。假手術組除不插線栓外余步驟同上, 并于24 h后取材。術后在約20 ℃的環境下單籠飼養，自由進水、進食。

1.3缺血后大鼠海馬CA1區TREK-1、GFAP表達檢測①定性檢測：采用熒光免疫組化法。造模后的各組大鼠快速斷頭取腦，將腦組織置于-80 ℃冷凍保存。-20 ℃恒冷切片機自視交叉處開始，行10 μm厚連續冠狀切片。冰凍切片置4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中(4 ℃)固定15 min，PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加3%普通驢血清(NDS/PBS)封閉液封閉2 h，棄血清，將相連切片分成兩組，分別滴加兔抗TREK-1(1∶200)、小鼠抗GFAP(1∶200)或兔抗TREK-1(1∶200)、小鼠抗NEUN(1∶200)進行雙標，4 ℃孵育過夜；PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加羊抗小鼠FITC(1∶200)和驢抗兔Cy3(1∶200),室溫避光孵育1 h，流水沖洗40 min后，50%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，激發/發射波長為550/565 nm的CY3呈紅色熒光，表示TREK-1蛋白；激發/發射波長為488/525 nm的FITC呈綠色熒光，表示神經元或星形膠質細胞染色；雙標陽性的星形膠質細胞為黃色。②定量檢測：采用Western blotting法。造模后的各組大鼠在腦缺血后相應時點快速斷頭取腦，在冰上迅速剝離出右側海馬，然后進行樣品的制備、蛋白溶度的測定、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉移電泳至PVDF膜，最后進行免疫酶染色，其過程如下：0.1%TBST洗PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗即兔抗TREK-1(1∶200)，4 ℃緩慢動搖過夜，0.1%TBST洗PVDF膜, 加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗IgG(1∶1 000)，室溫緩慢搖動1 h, ECL顯色液顯色，高敏膠片攝片洗片。另增加內參照蛋白β-actin檢測(兔抗β-actin，1∶200)，陰性對照組不加一抗，其余相同。測定Western blotting蛋白條帶的光密度(OD)值。

2結果

2.1大鼠海馬CA1區TREK-1、GFAP的定性表達TERK-1呈紅色熒光，雙標陽性的細胞呈黃色。TREK-1選擇性地表達于星型膠質細胞，神經元上未見有表達。在大鼠海馬CA1區可見形態正常呈樹根狀或放射狀的綠色熒光的星形膠質細胞(GFAP陽性)，亦可見到形態正常的呈綠色熒光的神經元(NEUN陽性)。GFAP是星形膠質細胞特異性標志物，NEUN是神經元特異性標志物，二者均呈綠色熒光。應用免疫熒光和激光掃描共聚焦觀察，MCAO再灌注后，星形膠質細胞增生肥大呈活化狀態，缺血再灌注后3、7、30 d 可見TREK-1和GFAP表達逐漸增強。

2.2MCAO再灌注后海馬CA1區TREK-1、GFAP表達變化Sham、MCAO 3 d、MCAO 7 d和MCAO 30 d組海馬區TREK-1蛋白表達水平分別是0.46±0.09、0.90±0.10、1.12±0.17和1.70±0.24，GFAP蛋白表達水平分別是0.40±0.07，0.74±0.08，0.94±0.14和1.40±0.20,Sham組與其他三組比較，P均<0.05；MCAO 30 d組與MCAO 3 d、MCAO 7 d組比較，P<0.05。

3討論

雙孔鉀離子通道(K2P，KCNK)是近年來發現的一類新型鉀離子通道，具有6個跨膜結構(6TMS)和2個孔道結構(2P)，廣泛分布于各種組織，在可興奮細胞和非可興奮細胞中均有發現[4]。通過鼠類中樞神經系統K2p基因原位雜交研究顯示，在所有的雙孔鉀離子通道亞型中，有7種表達于成年鼠類的中樞神經系統，包括TASK-1、TASK-3、TWIK-1、 THIK-1、TRAAK、TREK-1和TREK-2[8,9]。K2P對經典的鉀離子通道阻滯劑如四已基胺(TEA)、4-氨基吡啶(4-AP)等不敏感[4]，但能被體內外眾多生理病理因子及化學、機械刺激所調控[4,5,8]，包括多聚不飽和脂肪酸、神經遞質、溶血磷脂酸、第二信使、揮發性麻醉劑、臨床上的某些神經保護劑，還有細胞內外的pH值、滲透壓、氧分壓的改變、溫度變化及機械牽張等。K2P表達具有線性I-V關系的背景K電流，其電流是瞬時性和非失活性的，不具有時間和電壓依賴性[4,5]，參與調節背景鉀電流，在細胞膜電位的復極化和膜靜息電位的形成中起重要作用，并能穩定膜電位，調節細胞的興奮性[4]。

TREK-1是雙孔鉀離子通道的一種亞型，通過TREK-1基因敲除的小鼠研究表明，TREK-1在腦缺血中起著重要的腦保護作用，TREK-1-/-的小鼠對腦缺血損傷的敏感性明顯增加[10]。腦缺血過程中，花生四烯酸釋放，細胞內pH值下降，神經元發生腫脹。這些病理改變可在突觸前后開放 TREK-1。通道開放導致的超極化會抑制突觸前膜上電壓門控的鈣通道激活從而減少谷氨酸的釋放。在突觸后膜，超極化能加強鎂離子在負的膜電位下對NMDA受體的阻斷效應，這樣就減少了鈣離子的內流，從而降低谷氨酸的轉運和興奮毒性。突觸后水平TREK-1的開放還會對抗由離子型谷氨酸受體的激活引發的去極化。相反地，刺激代謝型谷氨酸受體會導致TREK-1的關閉，減少其神經保護作用[10,11]。

近年來對腦缺血研究一直集中于神經元，但迄今尚無有效根治措施。研究[12,13]表明，星形膠質細胞在腦缺血病理過程中起重要作用。腦缺血后星形膠質細胞肥大增生，呈活化狀態，即GFAP表達增強，不同時程可發揮保護或損害神經元的作用。星形膠質細胞的神經保護作用依賴于其表達特征性的具有線性I-V關系的被動電傳導，且具有低的膜電位(-75 mV)及低的膜電阻[14]。有研究[15]通過細胞培養離體實驗表明TREK-1功能性表達于海馬區成熟的星形膠質細胞，腦缺血后TREK-1與星形膠質細胞活化有一定關系，并認為腦缺血時所產生的損傷因子可能通過作用于星型膠質細胞K2P來影響膠質細胞的活化增植及緩沖功能，從而影響神經元的命運。

本實驗通過在體研究發現，鼠海馬CA1區TREK-1選擇性表達于星形膠質細胞，MCAO再灌注后，海馬TREK-1表達逐步上調且與星形膠質細胞的活化有一定關系。

參考文獻：

[1] Meeker RB, Azumta Y, Bragg DC, et al. Microglial proliferation in cortical neural culture exposed to feline immunodefieiency virus[J]. J Neuroimmunol, 1999,101(1):15-26.

[2] Swanson RA, Kauppinen TM. Astrocyte influence on ischemic neuronal death[J]. Curr Mol Med, 2004,4(2):193-205.

[3] Leis JA, Bekar LK, Walz W. Potassium homeostasis in the ischemic brain[J]. Glia, 2005,50(4):407-416.

[4] Florian L, Michel L. Molecular and functional properties of two-pore-domain potassium channels[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2000,279(5):793-801.

[5] Lesage F. Pharmacology of neuronal background potassium channels[J]. Neuropharmacology, 2003,44(1):1-7.

[6] Koizumi J, Yoshida T, Nakazawa T, et al. Experimental studies of ishemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats which recirculation can be introduced in the ischemic area[J]. Jpen J Stroke, 1986,8(1):1-8.

[7] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[8] Goldstein SA, Bockenhauer D, O′Kelly I, et al. Potassium leak channels and the KCNK family of two-P-domain subunits[J]. Nat Rev Neurosci, 2001,2(3):175-184.

[9] Edmund MT, Guillermo S, Qiubo L, et al. CNS Distribution of Members of the Two-Pore-Domain (KCNK) Potassium Channel Family[J]. J Neurosci, 2001,21(19):7491-7505.

[10] Heurteaux C， Guy N， Laigle C， et al． TREK-1， a K+channel involved in neumpmtection and general anesthesia[J]． EMBO J， 2004，23(13)：2684-2695.

[11]Yoshizumi M, Eisenach JC, Hayashida K. Riluzole and gabapentinoids activate glutamate transporters to facilitate glutamate-induced glutamate release from cultured astrocytes[J]. Eur J Pharmacol, 2012,29 677(1-3):87-92.

[12] Nedergaard M, Dirnagl U. Role of glial cells in cerebral ischemia[J]. Glia, 2005,50(4):281-286.

[13] Swanson RA, Kauppinen TM. Astrocyte influence on ischemic neuronal death[J]. Curr Mol Med, 2004,4(2):193-205.

[14] Leis JA, Bekar LK, Walz W. Potassium homeostasis in the ischemic brain[J]. Glia, 2005,50(4):407-416.

[15] Zhou M, Xu GJ, Xie MJ, et al. TWIK-1 and TREK-1 are potassium channels contributing significantly to astrocyte passive conductance in rat hippocampal slices[J]. Neurosci, 2009,29(26):8551-8556.