大腸癌干細胞標記物及其相關信號通路的研究進展

大腸癌干細胞標記物及其相關信號通路的研究進展

梅命珠，隋華，張怡，程悅蕾，柴妮，朱惠蓉

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203)

摘要：存在于大腸癌組織中的大腸癌干細胞，雖只占極少部分，但其對大腸癌的發生、發展起關鍵作用。目前，關于大腸癌干細胞的研究主要集中于大腸癌干細胞的篩選和鑒定方面及大腸癌干細胞的產生機制等，關于大腸癌干細胞的標記物有CD44、CD133、CD24、CD26、富含亮氨酸G蛋白偶聯受體5與乙醛脫氫酶1，大腸癌干細胞的相關信號通路包括Wnt、Hedgehog和Notch通路。這些信號通路在維持大腸癌干細胞生長及增殖中具有重要作用。

關鍵詞：大腸腫瘤；腫瘤干細胞；細胞表面標記物；信號通路

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.040

中圖分類號：R735.3文獻標志碼：A

基金項目：上海市中醫藥事業發展三年行動計劃(重大研究)項目(ZYSNXD-CC-ZDYJ048)。

收稿日期：(2015-06-01)

收稿日期：(2015-08-10)

腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中少量具有無限增殖和不定向分化潛能細胞群體，是形成不同分化程度腫瘤細胞和腫瘤細胞可不斷增殖及發生轉移的根源。與正常干細胞相比，腫瘤干細胞的增殖分化無序甚至失控，不能像正常干細胞那樣有序高效地分化成為成熟細胞，反而易出現各種錯誤，致使組織發生惡變。因此腫瘤干細胞的存在可能是腫瘤惡變的原因。起初，腫瘤干細胞最早被發現存在于血液系統的惡性腫瘤中。隨后，研究人員從乳腺癌實體腫瘤中分離出了腫瘤干細胞，首次證實了實體腫瘤中腫瘤干細胞的存在。此后，研究者先后從肺、消化道、前列腺、乳腺、結直腸等腫瘤的實體腫瘤中成功分離篩選出腫瘤干細胞。腫瘤干細胞的分離主要采用流式細胞法和免疫磁珠分選法，根據細胞表達不同表面標記的特征進行細胞群篩選，比較各組細胞的惡性生物學行為差異，從而篩選出優勢細胞的表面標記。目前大腸癌干細胞表面的特異性生物標記有CD44、CD133、CD24、CD26、富含亮氨酸G蛋白偶聯受體5 ( Lgr5) 與乙醛脫氫酶1(ALDH1)等。而諸多研究表明在大腸癌干細胞中存在著許多復雜的分子信號通路，如Wnt/β-catenin、TGF-β、Hedgehog以及Notch等信號通路在維持大腸癌干細胞的生長及增殖中具有重要作用，并且目前對其研究較為透徹?，F對大腸癌干細胞標記物及其相關信號通路的研究進展情況綜述如下。

通信作者：朱惠蓉

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1大腸癌干細胞的相關標記物

1.1CD44CD44是一種位于細胞膜上的多功能I類跨膜糖蛋白。作為細胞黏附分子主要參與細胞之間、細胞與基質之間的相互作用。Schulenburg等[1]在大腸癌組織中分離的CD44陽性和CD44陰性細胞的對比中發現，CD44陽性細胞無論是體內致瘤性，還是體外克隆形成能力，均明顯高于CD44陰性細胞。研究發現，CD44陽性細胞具有干細胞的特征，其表現出的增殖、侵襲能力明顯強于CD44陰性細胞[2，3]。因此，CD44已被公認為是大腸癌干細胞的標記物之一。

1.2CD133CD133最初被認為是造血干細胞和內皮祖細胞的標記物。其是一種5-跨膜糖蛋白，含有865個氨基酸。CD133最早被證明為結腸癌干細胞的表面標記，是通過小鼠腎被膜移植模型。研究發現CD133陰性細胞不能形成腫瘤，而CD133陽性的結腸癌干細胞具有自我更新和多向分化能力，以及傳代致瘤的特征，故從功能學的角度證明CD133作為結腸癌干細胞表面標記的合理性[4]。但隨后Shmelkov等[5]發現，CD133陽性和CD133陰性的腫瘤細胞移植到NOD/SCID的小鼠體內，則兩種細胞均能很快地生成腫瘤。而且，CD133陰性的腫瘤細胞更具有侵略性，形成腫瘤的速度更快，說明轉移的大腸癌細胞不論是否表達CD133，均具有引發腫瘤生成的能力。因此，CD133是否能作為大腸癌干細胞特異性的表面標記還有待于進一步研究。

1.3ALDH1 ALDH1是一種能催化細胞內的乙醛氧化為乙酸的解毒酶。已有研究證實，正常大腸組織干細胞存在于隱窩底部，主要表達ALDH1、CD133和CD44。故ALDH1被認為可用于鑒定正常腸道干細胞。而其與大腸癌腫瘤干細胞關系的研究，是在腫瘤組織和正常大腸組織的對比下進行。Huang等[6]在大腸癌組織中發現ALDH1高表達，并成功利用ALDH1的表達差異在動物模型內篩選出了大腸癌干細胞。此外，Dylla等[7]利用有限稀釋法所獲得的具有腫瘤干細胞特性的大腸癌細胞系，證明了ALDH1與大腸癌干細胞的相關性，并指出ALDH1的氧化作用是細胞對環磷酰胺發生耐藥的重要機制。臨床研究發現，大腸癌組織中ALDH1的染色程度與腫瘤細胞的分化程度間存在明顯的正相關性，且ALDH1陽性患者較ALDH1陰性患者生存期更短[8]。以上結果提示，ALDH1可作為一個標記大腸癌干細胞的表面標記物，并可作為判斷大腸癌患者疾病發展及其預后的重要指標。

1.4 Lgr5Lgr5是G-蛋白偶聯受體家族成員之一，是由具有18個富含亮氨酸的重復單位和7個跨膜區域組成的大分子蛋白，在人體內分布廣泛[9，10]。臨床研究發現[11]，結腸原發腫瘤組織中Lgr5 mRNA的表達較正常對照組上調了64%；在已建立的Lgr5轉基因裸鼠模型中，發現裸鼠于30周后成功長出結腸腺瘤，致瘤率達100%，提示Lgr5異常表達可誘導正常干細胞的腫瘤性增殖。此外，Kemper等[12]將Lgr5作為大腸癌干細胞的分選標記，發現Lgr5與腫瘤細胞間相互作用有關，因此認為Lgr5與大腸癌干細胞的侵襲轉移密切相關。

2大腸癌干細胞的相關信號通路

2.1Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin是與大腸癌發生、發展關系最為密切的信號通路，亦是目前干細胞研究中認識最為清晰的信號通路之一。主要分為“經典的Wnt/β-catenin/TCF”和“非經典的Wnt”。正常成熟細胞β-catenin水平低，Wnt信號通路處于關閉狀態。而腫瘤干細胞中，β-catenin降解障礙，胞質內游離β-catenin增多并與TCF/LEF-1結合進入細胞核，激活下游靶基因c-myc、cyclinD1轉錄，從而促進腫瘤的發生發展[13]。Vermeulen等[14]發現在大腸癌干細胞中，干細胞中Wnt/β-catenin信號高度活化，其上游主要靶基因Lgr5高水平表達，而普通成熟的大腸癌細胞中β-catenin信號幾乎不活化，且Lgr5基因表達水平較低，提示大腸癌干細胞的形成可能與Wnt/β-catenin信號的激活有關。Onishi等[15]研究發現，在干細胞微環境的刺激下，β-catenin的轉錄活性明顯高于普通腫瘤細胞；抑制Wnt信號通路的活化，可抑制腫瘤細胞生長。越來越多的證據[16]證實β-catenin信號在腫瘤干細胞的形成中發揮重要作用。因此，多數研究認為，Wnt/β-catenin信號通路是抑制腫瘤惡性病變的潛在靶點。

2.2TGF-β信號通路TGF-β信號通路可通過特異性結合并激活具有絲氨酸 / 蘇氨酸激酶活性的細胞表面受體啟動各種應答。通路中包括TGF-β、生長分化因子(GDF)、常見的活化素和骨形態發生蛋白(BMP)等。這些轉化生長因子能參與多項人體細胞的活動, 包括胚胎發生、免疫、骨骼形成與重建、腫瘤發生、血管形成、細胞增殖分化等多種人體生物學事件。 Akinyi等[17]通過觀察裸鼠腸上皮細胞標本，發現阻斷TGF-β信號通路，可使抑癌基因APC發生結構突變，最終導致裸鼠發生侵襲性結腸腺瘤。而沉默Smad基因之后，TGF-β信號通路激活，從而促進腫瘤細胞的增殖。Zubeldia等[18]將高表達TGF-β1的Mc38細胞注射到小鼠脾臟，發現TGF-β1不僅能促進原發腫瘤細胞的生長，還能促使癌細胞向肝臟轉移，這可能與TGF-β1引起了Mc38細胞中Smad基因的活化，從而增強細胞侵襲與遷移能力有關。Calon等[19]發現，在大腸癌發生肝轉移之后，大腸癌組織中包含的干細胞會向周圍組織中釋放TGF-β，使得周圍組織中的淋巴細胞、白細胞等免疫細胞釋放白細胞介素-11，從而導致腫瘤微環境發生改變，使得大腸癌細胞可在異質的器官中得以存活。Yu等[20]通過穩轉，使HCT116細胞株過度表達miR-21,發現TGF-β受體 (TGF-βR2)表達下調，而細胞株中干細胞比例增加，干細胞球的形成能力亦隨之增強。

2.3Hedgehog信號通路 Hedgehog信號通路是調控胚胎發育的一條經典信號轉導途徑，在細胞的增殖和分化方面亦扮演重要角色[21]。Hedgehog是一種跨膜蛋白受體復合物。研究發現，當Hedgehog與受體Ptc結合時，Hedgehog對下游Smoothened (Smo)激酶的抑制效應被解除，Smo被激活使得下游Gli因子的降解作用被抑制，Gli繼而從復合體中釋放出來以全長的形式進入細胞核中啟動相關基因表達[22]。多數研究已證實，膠質母細胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、多發性骨髓瘤及慢性髓樣白血病等的腫瘤干細胞均受到Hedgehog通路的調節作用，抑制這些細胞中HH通路的活性可明顯降低其致瘤能力。有研究發現，DDE(一種含氯的污染物)通過激活Hedgehog/Gli通路，能增加人結腸癌干細胞自我更新和分化、重建成結腸癌細胞群體的能力[23]。說明Hedgehog信號通路在維持腫瘤干細胞干性及調節腫瘤干細胞生物學方面起著重要作用。Yoshimoto等[24]研究發現，Hodgehog信號通路對大腸癌細胞功能起調控作用，這一作用表現在促進炎癥信號衰減和拮抗細胞凋亡兩方面，而這兩方面對于維持了促進大腸癌細胞增殖的腫瘤微環境的穩態具有重要調控作用。

2.4Notch信號通路 Notch 通路是腫瘤發生發展中研究較多的信號傳導通路，進化上高度保守，在維持細胞增殖、分化與凋亡間的動態平衡等方面發揮重要作用。一個完整的Notch信號通路包括Notch受體、Notch配體、細胞內效應分子CSL 蛋白、Notch靶基因、其他效應物和Notch的調節分子等。研究[25]發現，阻斷Notch通路可致人體內造血干細胞的減少和體外造血干細胞分化的加速，這提示Notch通路可能使胞核內與胞質內的相關蛋白結合，抑制與分化相關基因的轉錄，從而維持干細胞的未分化狀態。Fender等[26]發現，Notch-1可通過促進大腸癌細胞的上皮間質化，從而維持大腸癌干細胞的多向分化潛能。此外，激活Notch信號通路，大腸隱窩細胞的分化能力降低，而大腸干細胞的增殖能力卻明顯提高[27]。研究證明[28]敲除Notch基因會使結腸癌干細胞喪失成瘤能力，促進腫瘤細胞的凋亡。當將Notch信號通路的受體基因敲除后(特別是Notch2)，會引起其下游的Met原癌基因、干性轉錄因子Oct4與Nanog及CD44表達明顯下調[29]。Notch信號通路對于腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡等方面有重要調控作用。因此Notch信號通路上的基因，有可能成為將來大腸癌治療的潛在靶點。

3大腸癌干細胞的其他標記物及信號通路

腫瘤干細胞理論已在相關腫瘤中得到證實，但對它的研究尚處于初步階段。因此作為干細胞標記物的基因和活化的信號通路，正在被不斷發現。例如，CD24通過上調Src(酪氨酸激酶家族)，可激活ERK和PMAPK信號通路，從而促進腫瘤細胞的增殖分化，提示CD24亦是分選結腸癌干細胞的表面標記物之一[30，31]。在信號通路調控大腸癌干細胞的研究中，人們也逐漸發現這些通路之間并不是相互獨立的，上述Wnt、Hedgehog和Notch三條信號通路之間即存在著復雜的串聯。有研究表明Gli的活化能刺激Wnt靶基因的轉錄，同樣暗示Wnt此時相當于Hedgehog的下游通路。然而，在某些病理應答中，Wnt通路中的分子如GSK-3β和β-catenin，同樣也調節著Hedgehog通路中的特異位點。因此，有學者認為，Wnt、TGF-β、Notch、Hedgehog信號轉導通路組成了復雜的干細胞信號網絡調控體系，并且推測該體系可能還遠不止目前這些。而這些網絡之間的平衡對于干祖細胞的保持有重要意義，破壞這種信號網絡可能導致病理變化而發生腫瘤。

綜上所述，對正常干細胞分選標記物及信號傳導通路的進一步認識，使我們對大腸癌干細胞的發生發展有了更深入的了解。但目前仍有很多問題有待明確：第一、目前尚未發現具有代表性和有較高特異性的大腸癌干細胞標記物，而標記物形成的生物學機制亦丞待明確；第二，大腸癌干細胞來源及維持其自我更新能力的機制仍未明確；第三，大腸癌的發病常為多因素所致，而大腸癌干細胞在其中起何種作用，目前仍不明確；第四，如何特異性殺死大腸癌干細胞，而不損傷正常大腸組織，從而實現真正的靶向治療，目前尚缺乏有效的實施方法。因此，進一步深入研究大腸癌干細胞的分子生物學基礎及生物學特性的分子機制，對于提高大腸癌的預防、診斷、治療水平有重要意義。

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