響應面法優化谷氨酸亞鐵的制備工藝

黃 杰,于 新,刁麗婷,黃曉敏

(仲愷農業工程學院輕工食品學院,廣東 廣州 510225)

響應面法優化谷氨酸亞鐵的制備工藝

黃 杰,于 新*,刁麗婷,黃曉敏

(仲愷農業工程學院輕工食品學院,廣東 廣州 510225)

以氯化亞鐵和谷氨酸鈉為原料，在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法優化谷氨酸亞鐵的固液相法制備工藝條件，選定介質pH值、反應溫度和反應時間，通過中心組合試驗，建立二次回歸方程。結果表明，反應物物質的量比、介質pH值、反應時間及溫度對反應產物產率均有一定的影響。優化的制備工藝條件為谷氨酸與Fe2+物質的量比1∶1、介質pH 5.76、反應時間0.75 h、反應溫度58.9 ℃，產率為77.79%。反應產物谷氨酸亞鐵螯合物的組成為Fe(C5H7NO4)·2H2O。

谷氨酸亞鐵；響應面分析；食品添加劑；制備工藝；優化

鐵是人體必需的微量元素之一[1]，是血紅素、肌蛋白和細胞色素的重要組成部分和氧化還原酶的激活劑，鐵在人體中分布很廣。膳食中若長期缺鐵或鐵吸收障礙，可引起缺鐵性貧血，影響紅細胞的代謝，降低人體免疫功能，并對青少年兒童的生長發育造成嚴重影響，鐵代謝的重要性已遠遠超過紅細胞和血紅蛋白的范圍[2-3]。

食品與營養科學的研究表明，微量元素添加劑——氨基酸螯合物具有化學性能穩定、生物效價高、無毒無刺激性、適口性好、補充人體必須微量元素、增強人體免疫功能、提高人體抗應激能力等特性[4]。因此，氨基酸螯合物成為目前國際公認的最佳微量元素營養強化劑或添加劑。隨著乳鐵蛋白抑菌功能的發現及其應用技術的研究，人們利用動植物蛋白資源開發復合蛋白氨基酸亞鐵，但是純化的蛋白質使用成本高，且蛋白質與亞鐵的螯合率不高，產品質量檢驗方法與檢驗指標尚未完善。甘氨酸作為結構最簡單的氨基酸，其與Fe2+的反應得到了廣泛研究[5]。張大飛等[6]以甘氨酸和硫酸亞鐵銨為原料，采用熔融法合成甘氨酸亞鐵絡合物，確定其化學式為(NH2CH2COO)2Fe·2H2O；李大光等[7]以氯化亞鐵和甘氨酸為原料，利用一步室溫固相反應合成了一水合甘氨酸亞鐵；俞露等[8]以甘氨酸與碳酸亞鐵為原料，固液相法合成了陰離子干擾少、純度較高的甘氨酸亞鐵螯合物，判斷甘氨酸亞鐵是帶10個結晶水的反式結構螯合物。作為體內代謝的基本氨基酸之一的酸性氨基酸——谷氨酸[9-11]，其與亞鐵鹽的螯合物研究未見報道。

味精即谷氨酸鈉作為調味品或食品添加劑在中國、美國、英國、日本等國家已經食用100多年，能夠顯著增加食品的鮮味，并且是安全的。但是，在使用味精調味的同時，增加了Na+食用量，容易出現口渴、嗜睡的生理現象[12]。L-谷氨酸屬“非必需”，在人體內可由α-酮戊二酸產生。L-谷氨酸是一種氨基酸類藥物，用于肝昏迷、癲痢預防、減輕酮尿癥和酮血癥等，亦是一種腦營養劑，也可作肝臟藥物谷胱甘肽的生產原料[13]。以其制備谷氨 酸亞鐵，兼具調味、補充營養和預防缺鐵性貧血癥的作用。

本實驗以氯化亞鐵和谷氨酸鈉為主要原料，通過控制反應條件和降低產物在有機溶劑中的溶解度，探尋制備谷氨酸亞鐵的工藝。根據多元回歸分析多個獨立變量及其交互關系對依變量的影響[14]，應用響應面法優化谷氨酸亞鐵的制備工藝，旨在對谷氨酸亞鐵的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碳酸鈉、氯化亞鐵、鐵粉、氫氧化鈉（均為分析純） 天津市福晨化學試劑廠；乙醇（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；鹽酸（分析純） 廣州化學試劑二廠；谷氨酸鈉 河南蓮花味精股份有限公司。

1.2 儀器與設備

UV1800紫外光譜儀 日本島津公司；PerkinElmer Spectrum 100（84544）傅里葉變換紅外光譜儀 美國珀金埃爾默公司；HCT-1型微機差熱天平 北京恒久科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 谷氨酸亞鐵的制備

將一定量的碳酸鈉和氯化亞鐵分別溶于適量去離子水，攪拌，將碳酸鈉溶液緩慢加入氯化亞鐵溶液中，充分反應。靜置，過濾，用蒸餾水洗滌沉淀物，直至無氯離子檢出為止。

將一定量的谷氨酸鈉溶于適量去離子水，用0.05 mol/L鹽酸調至pH 3.22，使其發生沉淀，靜置過濾，得谷氨酸。將新制得的碳酸亞鐵傾入谷氨酸的熱水溶液中，同時加入鐵粉，調至pH 4.0～5.0。加熱攪拌，80 ℃恒溫反應60 min。過濾，濾液濃縮，加入適量無水乙醇使沉淀析出[15]。抽濾，洗滌，真空干燥，稱量，得產物谷氨酸亞鐵。

其反應式為:

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 介質pH值對產率的影響

選取pH值范圍4～7、投料物質的量比1∶1、反應溫度60 ℃、反應時間1.0 h。以反應產物產率為評價指標，考察介質pH值對谷氨酸亞鐵制備的影響。

1.3.2.2 反應溫度對產率的影響

選取反應溫度范圍30～90 ℃、介質pH 6、投料物質的量比1∶1、反應時間1.0 h。以反應產物產率為評價指標，考察反應溫度對谷氨酸亞鐵制備的影響。

1.3.2.3 反應時間對產率的影響

選取反應時間范圍0.5～3 h、介質pH 6、投料物質的量比1∶1、反應溫度60 ℃。以反應產物產率為評價指標，考察反應時間對谷氨酸亞鐵制備的影響。

1.3.2.4 投料物質的量比對產率的影響

選取谷氨酸與Fe2+物質的量比范圍1∶1～3∶1、介質pH 6、反應溫度60 ℃、反應時間1.0 h。以反應產物產率為評價指標，考察投料物質的量比對谷氨酸亞鐵制備的影響。

1.3.3 響應面試驗

根據單因素試驗結果設定因素水平，采用Design-Expert 8.05b軟件設計響應面試驗方案，以反應產物產率為響應值，優化谷氨酸亞鐵的制備工藝條件。

1.3.4 產物的鑒定方法

真空干燥產物，定量測定產物結晶水數目；紫外-可見分光光度法、紅外光譜法配合確定螯合物是否生成[16-18]；示差掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）法分析測定螯合物結晶水分解溫度、螯合物的熔點。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 介質pH值對谷氨酸亞鐵產率的影響

谷氨酸和Fe2+的配位反應與介質pH值有密切關系。谷氨酸的等電點3.22，在pH值小于4的酸性條件下，H+與Fe2+爭奪供電子基團，H+易與谷氨酸根離子結合生成谷氨酸，從而不利于谷氨酸亞鐵螯合物的形成；在pH值大于7的堿性條件下，Fe2+易氧化水解，生成Fe(OH)3沉淀。因此，本試驗選取pH 4～7范圍進行考察。由圖1可見，在pH 4～7范圍內均可生成谷氨酸亞鐵，pH值對產物的配位比影響不大，但對產率有較大的影響。pH值不大于6時，產物產率隨著介質pH值的升高而增大；pH值不小于6時，產物產率逐漸減小。依據試驗結果，選擇pH 6.0設計響應面試驗。

2.1.2 反應溫度對谷氨酸亞鐵產率的影響

反應溫度對谷氨酸和Fe2+的配位反應有影響。升高溫度可以加快反應速率，但促進Fe2+水解，生成Fe(OH)3沉淀，且影響產物的穩定性。在30～60 ℃范圍內，隨反應溫度升高，產物產率增加；溫度大于60 ℃，產物產率明顯降低（圖2）。螯合反應是一個放熱反應[19]，升溫雖然可加快反應速率，但抑制正反應的進行。選擇溫度60 ℃設計響應面試驗。

2.1.3 反應時間對谷氨酸亞鐵產率的影響

碳酸鈉和氯化亞鐵的反應為復分解反應，反應速率快，因此在制備碳酸亞鐵過程中，緩慢攪拌加入碳酸鈉溶液，反應15～30 min即可。如圖3所示,碳酸亞鐵與谷氨酸的反應時間達到1 h時產率較高。此后，由于Fe2+在空氣中易被氧化，隨反應時間延長，產物產率降低。因此選用反應時間1.0 h設計響應面試驗。

2.1.4 投料物質的量比對谷氨酸亞鐵制備的影響

配位比即配體與金屬離子的物質的量之比[20]，它是影響金屬離子與氨基酸配位反應的一個重要因素，配位比對反應產物的產率、產物中Fe2+的含量（質量分數）有較大影響。碳酸鈉與氯化亞鐵按1∶1的物質的量比投料進行反應，防止任何一種物質過量而影響碳酸亞鐵的純度。

由圖4可知，在物質的量比為1∶1～2∶1時，隨谷氨酸量的增加，產物產率隨之增加，Fe2+含量有增加的趨勢，但不明顯。谷氨酸和Fe2+物質的量比為2∶1時，產物中Fe2+含量達到最高。當物質的量比大于2∶1，Fe2+含量有所降低，而產率繼續增加，但增幅減小。這是因為增加谷氨酸物質的量，促進反應正向進行，使產率增大，但同時也會增加產物中游離谷氨酸的含量，使亞鐵的含量降低。綜合考慮，選取1∶1作為谷氨酸與Fe2+制備谷氨酸亞鐵配合物的最佳物質的量比，用在響應面試驗中。

2.2 產物鑒定

2.2.1 產物的物理性質

墨綠色粉末，不透明，鮮味突出，溶于水。取2 g樣品，160 ℃真空干燥至質量恒定，失質量0.30 g，占15%，與失去兩分子結晶水的理論值相當，即該化合物帶兩個結晶水，符合化學式Fe(C5H7NO4)·2H2O。

2.2.2 紫外光譜分析

分別配制1.0%的谷氨酸、谷氨酸亞鐵溶液，在200～600 nm波長范圍測其吸收光譜。

由圖5可知，谷氨酸遠紫外區最大吸收峰位于205 nm波長處，谷氨酸亞鐵位于214 nm波長處，向長波方向移動9 nm。相同質量分數時，谷氨酸亞鐵最大吸收峰高度比谷氨酸有明顯的增高，且在303 nm波長附近有一寬肩峰。符合金屬氨基酸螯合物的生成會使其近紫外吸收峰發生紅移一般規律。由此可證明谷氨酸亞鐵螯合物的生成。這與已有研究[21-22]中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、賴氨酸的銅、鋅螯合物的紫外吸收峰紅移具有類似結果。

2.2.3 紅外光譜分析

K B r壓片法測定谷氨酸和谷氨酸亞鐵在400～4 000 cm-1的紅外光譜。

從圖6可知，谷氨酸與Fe2+形成螯合物后，其主要吸收峰數量、峰形、波數、強度與配體相比發生了明顯變化。谷氨酸在3 650～3 200 cm-1間出現游離O—H基的伸縮振動吸收，羥基濃度高，形成氫鍵的能力更強，發生締合現象，O—H基伸縮振動吸收峰向低波數方向位移，在3 100～2 900 cm-1出現一個強吸收峰，峰形尖銳，而谷氨酸亞鐵則是在3 100～3 500 cm-1間有一較寬的強吸收峰，較谷氨酸配體向高波數移動，表明谷氨酸亞鐵中游離O—H基濃度低，不存在分子間的締合作用，O—H基與Fe2+發生了反應。谷氨酸在3 069 cm-1處的N—H鍵伸縮振動的特征吸收峰，在形成配合物后發生了位移，且在1 500 cm-1附近無NH3+的彎曲振動峰。在540 cm-1處出現了Fe—N的伸縮振動峰[23]，說明α-氨基N原子參與了配位。在1 619 cm-1和1 406 cm-1出現的吸收峰分別是COO-的反對稱和對稱伸縮振動峰，較配體向高波數移動（谷氨酸的COO-的反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動為1 517 cm-1和1 311 cm-1），表明C1羧基是以單齒方式配位。配合物中仍有羧基的特征峰（3 375 cm-1左右），表明谷氨酸中C5羧基未參與配位[24-25]。

2.2.4 DSC分析

取5 mg樣品，在HCT-1型微機差熱天平上以α-Al2O3為參比在氮氣氣氛中進行測試，升溫速率20 ℃/min，溫度范圍20～200 ℃。從圖7可看到，DSC曲線在132 ℃有一吸熱峰，說明螯合物結晶水受熱分解，DSC曲線在171.9 ℃有一吸熱峰，螯合物在此溫度左右開始熔化，慢慢發生分解。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗

依據單因素試驗結果，確定各因素水平取值。采用Design-Expert 8.05b軟件設計響應面試驗方案（表1），根據試驗結果得到數學模型為:

Y=-136.3+42.58A+3.042B+4.307C-0.192 0AB+ 0.220 0AC-0.056 00BC-2.726A2-0.016 06B2-1.526C2

根據表2方差分析，數學模型P=0.001 3＜0.05，說明該模型顯著；失擬項P=0.944 1＞0.05不顯著，R2=0.944 2，變異系數0.41%，說明該數學模型對試驗擬合較好，試驗誤差小，可以用來預測試驗結果。3 個因素對試驗結果均有一定的影響，各個因素對谷氨酸亞鐵的制備工藝條件影響的次序由大到小依次為:A＞B＞C，即介質pH值＞反應溫度＞反應時間；因素間的交互作用AB對試驗結果也有一定的影響[26-27]。

2.3.2 驗證實驗結果

根據所建立的數學模型，得到響應值最大時的優化條件:介質pH 5.76、反應溫度58.9 ℃、反應時間0.75 h。按照此條件重復3次實驗，產率分別為78.1%、77.61%、77.68%，回歸方程所得的預測值77.64%與驗證實驗的平均值77.79%相差不大，因此，谷氨酸亞鐵的最佳制備工藝條件為:介質pH 5.76、反應溫度58.9 ℃、反應時間0.75 h、投料物質的量比1∶1。

3 結 論

本實驗以氯化亞鐵和谷氨酸鈉為主要原料，通過固液相反應法制得陰離子干擾少、穩定性好的谷氨酸亞鐵。通過響應面法優化獲得的較佳制備工藝條件為投料物質的量比1∶1、介質pH 5.76、反應溫度58.9 ℃、反應時間0.75 h，產率為77.79%，其組成為Fe(C5H7NO4)·2H2O。該制備反應工藝簡單，原料成本較低，易實現工業化生產。

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Optimization of the Preparation Process of Ferrous Glutamate by Response Surface Methodology

HUANG Jie, YU Xin*, DIAO Liting, HUANG Xiaomin
(College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)

Ferrous glutamate was prepared from ferrous chloride and sodium glutamate by a solid-liquid phase method. The preparation process was optimized using combination of single factor method and response surface methodology. A quadratic regression model indicating the effect of three variables including medium pH, reaction temperature and time on ferrous glutamate yield was established using a central composite design. The results showed that the optimal conditions for preparing ferrous glutamate were determined as follows: molar ratio of C5H9NO4to Fe2+, 1:1; medium pH, 5.76; reaction temperature, 58.9 ℃; and reaction time, 0.75 h. Under these conditions, the yield of ferrous glutamate was 77.79%. The chemical formula of the ferrous glutamate was Fe(C5H7NO4)·2H2O.

ferrous glutamate; response surface methodology; food additive; preparation process; optimization

O614.81

A

10.7506/spkx1002-6630-201510016

2014-09-29

黃杰(1989—),男,碩士研究生,研究方向為食品添加劑。E-mail：lawrence0817@163.com

*通信作者：于新(1959—),男,教授,碩士,研究方向為農產品貯藏與加工。E-mail：yuxin1959@aliyun.com