大蒜素抗運動性氧應激和DNA損傷的作用研究

蘇美華　楊多多　許慶忠

摘要：目的：觀察補充大蒜素對人體力竭運動后外周血細胞DNA的損傷效應及血清中SOD、GSH和MDA活性的影響，探討大蒜素抗DNA氧化損傷的作用機制。方法：選取16名健康男運動員（年齡21.06±1.02歲），隨機分為兩組包括對照組8名（C組，補充淀粉安慰劑膠囊）和實驗組8名（T組，補充大蒜素膠囊），運動前14天各組每天分別口服安慰劑和大蒜素膠囊，補劑后所有被試均參加Bruce力竭運動方案，并分別在補劑前、補劑后和運動后即刻這三個階段對兩組受試者進行采血抗凝，采用單細胞凝膠電泳（SCGE）技術檢測人體外周血細胞DNA損傷情況，并測定血漿中超氧化物岐化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量。結果：補劑前和補劑后，對照組和實驗組的DNA損傷水平與氧化應激水平無顯著性差異（P>0.05）；運動后即刻實驗組運動員外周血細胞的DNA損傷水平顯著低于對照組力竭運動后的水平，其MDA水平、SOD和GSH含量較力竭對照組亦出現顯著降低（P<0.001， P<0.05， P<0.05）；而對照組運動后即刻SOD、GSH和 MDA水平較運動前均出現顯著上升，DNA損傷值明顯加?。≒<0.001）。結論：力竭運動可誘導人體外周血細胞DNA損傷值增加及脂質過氧化產物MDA水平的升高，介導SOD和GSH抗氧化酶活性的過量表達，大蒜素能夠提高機體抗氧化能力，降低自由基水平，減輕和預防運動性氧應激所致的DNA損傷。

關鍵詞：大蒜素；DNA損傷；氧化應激；力竭運動

中圖分類號：G804.7文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2014）06-0087-05

Abstract：Objective：This study was performed to determine the effect of allicin against DNA damage and oxidative stress on human peripheral blood cell after exhaustive exercise， and discuss the protective mechanism of allicin. Methods：16 male athletes （aged 21.06±1.02 years）， in a randomized and double-blind design were allocated in two equal supplement and placebo groups （80mg/day allicin for 14 days）. After supplementation， all participants were participated in Bruce test. The blood samples were taken in three phases （before and after the supplementation and after the exercise）. The DNA damage was investigated on human peripheral blood cell by using the single cell gel

收稿日期：2014-09-20

基金項目：福建省自然基金青年項目（2013J05055），福建省教育廳A類項目（JA13199）。

作者簡介：蘇美華（1983-），女，福建泉州人，博士，講師，研究方向運動生理與體育健康促進。

作者單位：1.閩南師范大學體育學院，福建 漳州3630001；2.畢節學院體育與健康科學學院，貴州 畢節551700

1. School of Physical Education， Minnan Normal University， Zhangzhou 363000， Fujian， China；2. College of P. E. and Health Sciences， Bijie University， Bijie 551700， Guizhou， Chinaelectrophoresis （SCGE） and the level of SOD， GSH and MDA was detected in serum.Results：During the first two phases（before and after the supplementation）， the level of DNA damage and the status of SOD，GSH and MDA between supplement and placebo groups did not show significant difference（P>0.05）. Moreover， exercise-induced decrease of DNA damage and the level of SOD， GSH and MDA in the supplement group were significantly more in comparison with those in the placebo group （P<0.001），instead，the DNA damage and the level of SOD， GSH and MDA increased significantly after exercise. Conclusions： The exhaustive exercise could result in the DNA damage on human peripheral blood cell and induce high level of oxidative stress. However， the allicin could reduce free radicals and prevent DNA damage from oxidative stress induced by exhaustive exercise.

Key words：allicin； DNA damage； oxidative stress； exhaustive exercise

大蒜是食藥兩用的蔬菜之一，也是日常飲食中的重要調味品。中醫認為其具有“除寒濕、辟陰邪、袪毒氣、破惡血、消痛腫、化肉食”之功效。大蒜素則是從大蒜中提取出來的一種有效成分，其主要成分的化學名稱為二烯丙基二硫醚?，F代研究發現，大蒜素具有很高的營養和藥用價值，特別是大蒜素具有降血脂、降血壓、保護血管、調節免疫功能、抗疲勞、抗輻射、抗腫瘤、抗病菌等作用，并能清除自由基，抗脂質過氧化減輕活性氧對機體造成的氧化損傷[1-3]。大強度耐力運動可引起體內過量自由基產生及氧化應激，并對機體產生一系列危害[4-5]。動物實驗已經證明過量運動可誘發心肌、血細胞的DNA損傷[6]。但目前關于大蒜素對劇烈運動引起機體組織DNA損傷所具有的保護效應如何，其相關研究報道還較少，而運動補劑和營養干預對于提高運動成績和促進體能康復具有重要的作用，也是運動醫學領域研究的熱點。為此，本研究擬采用單細胞凝膠電泳技術（single cell gel electrophoresis， SCGE）[7]，檢測力竭運動后人體外周血細胞的DNA損傷情況，通過補充大蒜素觀察其對人體外周血細胞DNA損傷的保護作用和抗氧化效應，并探討其作用機制，為運動疲勞的預防與消除提供一種新方法，為開發具有抗氧化活性的保健食品提供實驗和理論依據。

山東體育學院學報第30卷第6期2014年12月 蘇美華，等大蒜素抗運動性氧應激和DNA損傷的作用研究No.6 20141研究對象與方法

1.1研究對象

選取閩南師范大學體育學院體育專業男生16名，隨機分為兩組包括實驗組8名（T組，補充大蒜素膠囊）和對照組8名（C組，補充淀粉安慰劑膠囊），均無吸煙史，體檢健康狀態良好，自愿參與此次實驗，實驗期間遵守規律的合理膳食。

1.2研究方法

1.2.1運動方案

受試者在Lode Valiant 醫用電動跑臺上采用Bruce方案[8]進行力竭運動。力竭標準為：1）受試者經再三鼓勵，也無法保持該運動強度；2）運動過程中心率達到180次/min以上；3）RPE數值達到19或20。

1.2.2血樣采集及服用補劑方法

對照組受試對象從運動前2 周開始每天口服安慰劑，劑量為每天80 mg；實驗組受試對象同時間每天口服大蒜素膠囊，劑量為每天80 mg[9]。實驗的第一天，對所有被試進行身高、體重和體成分的測定；在補劑之前、補劑第14天、第15天運動后即刻分別采集兩組受試者外周靜脈血1 mL，放入含有0.1 mg肝素的抗凝管，取每個被試抗凝血10～15 μL用于SCGE檢測，余下的抗凝血立即冷凍離心后用于抗氧化酶與脂質過氧化水平的測定。

1.2.3血細胞DNA損傷檢測

膠片制作參照Hartmann[10]的方法稍加改進。將制好的載玻片置于水平電泳槽中，倒入新配置的堿性電泳緩沖液約覆過膠面0.25 cm左右，解旋20 min，以便使DNA解螺旋成單鏈，使DNA斷片在電泳場中易于遷移。解旋后在25 V、250 mA的條件下電泳30 min。停止電泳后小心地將玻片放入中和緩沖液中中和15 min。取出玻片，滴加30～50 μL 濃度為5μg/ mL的EB染液到膠體表面，蓋上蓋玻片，染色15～20 min后熒光顯微鏡觀察。

1.2.4抗氧化酶與脂質過氧化水平的測定

SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA測定采用硫代巴比妥酸比色法，GSH測定采用比色定量法。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3主要儀器和試劑

DYY-6C型三恒電泳儀和DYZC-24B型電泳槽（北京，六一）；BX-51型熒光顯微鏡和E-330型數碼像機（OLYMPUS）；721可見光分光光度計；ECOM-F6124型半自動生化分析儀。肝素抗凝劑、低熔點瓊脂糖（LMA）、正常熔點瓊脂糖（NMA）、肌氨酸鈉、Triton X -100二甲基亞砜（DMSO）及溴化已錠（EB）等均購自Amresco公司；大蒜素膠囊購于江蘇正大清江制藥有限公司（國藥準字H32025683），其它試劑均為優級分析純。

1.4統計分析

熒光顯微鏡下用515～560 nm 的激發光觀察，在200 ×下，每張涂片上隨機觀察5個視野，每個視野多于5個細胞，每組6張載波片。用IMI1.0（深圳良正軟件開發有限公司）彗星分析軟件測定彗星長、尾長、尾部DNA百分數、彗星分布矩、尾慣量、Olive尾矩等指標， 用EXCELL和SPSS軟件對所獲得數據進行正態檢驗（1-Sample K-S）和單因數方差分析（One-Way ANOVA），結果以mean±SD表示。P< 0.05表示組間差異顯著性。

2結果

2.1受試者身體形態指標簡況

受試者的基本情況見表1，對照組和實驗組受試者身體特征基本一致，表現在身體形態指標身高、體重、BMI值、體脂百分比無顯著差異，而對照組和實驗組在各自補充補劑后，實驗組補充大蒜素后力竭時間顯著長于對照組（P< 0.01）。表1受試者基本情況一覽表

組別年齡身高（cm）體重（kg）BMI 體脂%力竭時間（min）對照組21.37±1.06172.3±1.6664.87±2.1021.78±0.9813.98±2.4315.87±1.12實驗組20.75±1.03172.25±1.8365.37±1.8321.69±0.5114.03±1.3816.87±0.83**注：與對照組相比，**P<0.01。

2.2服用大蒜素前后對人體外周血細胞DNA損傷的形態學觀察

染色后的涂片在熒光顯微鏡下觀察發現，補劑前安靜狀態下對照組和實驗組運動員外周血細胞絕大部分表現為一圓形熒光團，熒光強度均勻，邊緣光滑，即彗星頭部，無明顯拖尾現象（圖A1和A2）；對照組和實驗組連續14天服用補劑后，安靜狀態下運動員外周血細胞絕大部分也表現為一圓形熒光團，熒光強度均勻，邊緣光滑，即彗星頭部，無明顯拖尾現象（圖B1和B2）；實驗組在進行Bruce力竭運動方案后即刻，運動員外周血細胞尾部的熒光強度增強，只有部分細胞出現“彗星尾”， “彗星尾”尾長并無明顯加長 （圖C1） ；而對照組在進行Bruce力竭運動方案后即刻，運動員外周血細胞尾部的熒光強度增強，“彗星”尾部逐漸變長變大，彗星頭部的直徑隨著尾部的加長而減小，彗星樣細胞的出現率明顯升高 （圖C2）。

圖1服用大蒜素后運動員

外周血細胞DNA彗星圖（×100）2.3服用大蒜素后人體外周血細胞DNA損傷的SCGE檢測指標變化情況

彗星圖像用彗星分析軟件并選取國際通用指標[7，10]尾長、尾分布矩和Olive尾矩等指標進行分析的結果見表2。補劑前安靜狀態下對照組和實驗組運動員外周血細胞的彗星檢測指標尾長、Olive尾矩、 尾分布矩并無顯著差異（P>0.05）；對照組和實驗組連續14天服用補劑后，運動前大蒜素補劑組運動員外周血細胞的彗星檢測指標尾長、Olive尾矩、 尾分布矩均顯示較對照組有降低趨勢，但無統計上的顯著差異（P>0.05）；運動后即刻，對照組運動員外周血細胞的彗星檢測指標尾長、Olive尾矩、 尾分布矩均顯示較運動前有非常顯著的升高（P<0.001），而大蒜素補劑組運動員外周血細胞的彗星檢測指標尾長、Olive尾矩、 尾分布矩較對照組有顯著地降低（P<0.01），提示大蒜素顯著地降低了力竭運動導致運動員外周血細胞的DNA損傷程度。

2.4服用大蒜素后運動員機體血清中SOD酶活性、GSH與MDA含量的變化

從表3可知，補劑前安靜狀態下對照組和實驗組運動員機體血清中SOD酶活性、GSH與MDA含量并無顯著差異（P>0.05）；補劑后安靜狀態下對照組和實驗組運動員機體血清中SOD酶活性、GSH與MDA含量也無顯著性差異（P>0.05）；而力竭運動后對照組運動員機體血清中SOD酶活性、GSH與MDA含量與補劑前安靜狀態下的水平相比，均呈顯著性提高（P<0.05， P<0.05，P<0.001），與此同時，力竭運動后實驗組運動員機體血清中SOD酶活性、GSH與MDA含量較對照組運動后的水平相比，均呈不同程度地顯著性降低（P<0.05， P<0.05，P<0.001），而與補劑前安靜狀態下的對照組和實驗組水平相比并無顯著差異（P>0.05），提示大蒜素有效降低脂質過氧化產物水平。表2大蒜素對運動員外周血細胞DNA損傷指標的影響

組別N尾長Olive 尾矩尾分布矩C組補劑前835.12±10.1214.56±3.2678.94±24.78T組補劑前835.92±8.6214.61±4.9779.38±17.64C組補劑后834.88±10.0814.48±4.75 77.85±18.42T組補劑后834.16±7.24 14.38±3.78 75.17±21.45C組運動后862.90±12.61***21.15±4.61***95.00±27.58***T組運動后842.60±11.29▲▲15.81±3.82*▲▲83.16±19.71▲▲注：與C組補劑前相比，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001； 與C組運動后相比， ▲▲P<0.01， ▲▲▲ P<0.001。

表3大蒜素干預后運動員血清中SOD、GSH和MDA的變化

組別NSOD（U/ml）GSH（mg/L）MDA （nmol/ml）C組補劑前790.37±13.64103.75±14.214.34±0.92T組補劑前788.63±14.11105.38±16.464.56±1.03C組補劑后798.25±12.10107.13±18.064.29±0.93T組補劑后799.63±17.62100.75±14.27 4.16±1.07C組運動后122.63±15.09*127.13±19.56*7.74±1.11***T組運動后102.13±11.89▲106.38±24.64▲5.40±1.04▲▲▲注：與C組補劑前相比，*P<0.05， ***P<0.001； 與C組運動后相比， ▲P<0.05， ▲▲▲P<0.001。

3討論

近年來研究發現大蒜素具有抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、抗感染、清除自由基、預防心腦血管疾病等多種功效[1-3]。已有臨床研究證實，大蒜素可有效降低糖尿病大鼠的MDA水平，減輕氧化應激損傷的程度[11]。劇烈運動可使體內活性氧產生，脂質過氧化增強如MDA水平升高，導致運動能力下降和引發運動疲勞，其產生機制之一是由于運動過程中呼吸頻率的增加，致使空氣污染物NO2和O3等隨著呼吸攝入增多而增多，而這些自由基正是通過呼吸道增加了氧化損傷的機率[12]。然而機體細胞擁有一個復雜的網絡工作機制來抵抗活性氧（ROS）自由基的產生進而來保護大分子物質免遭侵害，這些工作通常由抗氧化物質SOD、GSH、AA和VE等來完成，通過攝入抗氧化物質也是一個非常重要的渠道[13]。DNA是活性氧（ROS）自由基攻擊的重要靶分子，自由基氧化還原反應可引起DNA分子的堿基修飾或鏈斷裂等多種后果，導致一系列生理功能紊亂和組織病理學改變，甚至是癌變，且DNA的損傷程度與疾病的嚴重程度密切相關[14]。國外一些研究報道了大強度運動會導致DNA的損傷，其損傷程度與運動強度、時間和個體水平有關[15-16]。實驗室前期研究發現運動性氧應激參與介導了組織細胞的DNA損傷，且DNA的損傷程度與氧化應激水平呈正相關[17-18]。因此本實驗進一步采用SCGE檢測技術發現，補充大蒜素運動員力竭運動后外周血細胞的DNA損傷水平顯著低于對照組力竭運動后的水平?？梢?，大蒜素對力竭運動所致的DNA損傷具有明顯的保護效應。Hassan Farhad[19]等研究發現，補充大蒜素能夠明顯降低人體運動后DNA氧化損傷的修飾物之一即8-羥基鳥苷（8-OHDG）的含量，這與本研究結果相類似。

SOD和GSH 是體內抗氧化系統中主要的抗氧化生物標志物，MDA是氧自由基對多價不飽和脂肪酸引發的脂質過氧化反應的最終產物，它們的含量高低可反映機體組織細胞脂質過氧化反應的強度及體內自由基代謝的情況[20]。本實驗結果發現，對照組力竭運動后血清MDA水平顯著上升，SOD和GSH抗氧化酶活性也出現顯著地代償性升高，且DNA損傷水平較對照組運動前水平亦呈顯著增加趨勢，說明力竭運動使脂質過氧化產物MDA水平顯著升高，導致DNA氧化損傷程度加深，同時機體組織以過量表達SOD和GSH來提高機體抗氧化系統能力，清除羥基，降低過氧化壓力，減少劇烈運動負荷引起的大量毒性的活性氧[2]。然而，力竭運動后補充大蒜素組運動員機體血清中SOD酶活性、GSH與MDA含量較對照組運動后的水平相比，均呈不同程度地顯著性降低，且DNA損傷水平較對照組運動后水平呈顯著降低趨勢，說明補充的大蒜素直接參與了清除運動過程中產生的自由基，并顯著降低了機體的脂質過氧化程度，從而降低了人體外周血細胞的DNA損傷值。此實驗結果與其他研究[9]發現大蒜素較其它抗氧化劑更能有效降低運動員機體氧化應激水平的結論相一致。而大蒜素的補充劑量效應還有待進一步研究。

4結論

力竭性跑臺運動可誘導人體外周血細胞DNA損傷值增加及脂質過氧化產物MDA水平的升高，介導機體組織SOD和GSH抗氧化酶活性的過量表達，大蒜素能夠提高機體抗氧化能力，穩定細胞膜結構，降低自由基水平，減輕和預防運動性氧應激所致的DNA損傷，對防治運動疲勞具有較好的營養保健功效。

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