浸礦微生物生物膜的形成與調控研究現狀

孫 慧，谷亞冰，馬麗媛，肖云花，梁伊麗，劉學端

（1．中南大學 生物冶金教育部重點實驗室，湖南 長沙 410083；2．中南大學 資源加工與生物工程學院，湖南 長沙 410083）

我國有色金屬礦產資源品位低，組成復雜，難于處理，常規選冶成本較高，易造成環境污染等問題。生物冶金技術可以利用微生物將硫化礦等礦物中的非水溶性有價金屬轉變成可溶形式加以回收，是低品位硫化礦選冶的重要技術［1］。

生物冶金系統中，微生物的作用有非接觸機制和接觸機制。非接觸機制是指浮游細菌將浸出體系或硫化礦氧化過程中產生的Fe2＋氧化成Fe3＋，Fe3＋作為強氧化劑進一步氧化分解硫化礦，從而浸出有價金屬；而接觸機制是指浸礦微生物吸附于礦物表面，產生相關的酶（如鐵氧化酶和硫氧化酶），直接將硫化礦氧化分解為金屬離子和硫，細菌進一步將硫氧化為硫酸［2］。研究發現，生物浸出過程中，微生物及其分泌的胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS）以生物膜的形式吸附在礦物表面，營造自身生長的微環境，在有價金屬浸出過程中發揮重要作用［3］。

生物膜是與浮游生長相對應的一種生長方式。生物膜內的細胞相互協調，以多細胞群體形式組成復雜結構，其形成是十分復雜的生物學、化學過程，且受環境因素影響［4］。對生物冶金體系中生物膜的形成及其與礦物之間的作用機制的研究尚處于起步階段。本文綜述了近年來生物冶金體系中生物膜的組成、生物膜的形成過程及與礦物浸出的關系，以及生物膜調控機制方面的最新進展。

1 浸礦微生物生物膜的組成

生物冶金體系中，吸附在礦物表面的微生物本身及其分泌的EPS，以及部分浸出產物如單質硫、非水溶性多硫化合物、鐵礬、硫酸鉛等在礦物表面與溶液之間組成生物膜［5-6］。生物膜中的胞外多聚物主要包括多糖、蛋白質、核酸和脂類，它們介導微生物礦物表面的附著，形成一個具有三維結構的聚合物網絡，保證生物膜的機械穩定性；此外，作為一個外部消化系統，胞外多聚物使胞外酶能夠接近細胞，代謝可溶性、膠體或固體的生物物質［7］。

近年來，隨著熒光標記、共聚焦激光掃描顯微鏡、原子力顯微鏡、基因組學和蛋白組學等新興技術的發展，浸礦菌中新的生物膜組分相繼被發現［8］。S．Bellenberg等［9］利用熒光標記的伴刀豆凝集素發現以亞鐵為能源培養的acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270生物膜中含少量的莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPS），將細菌轉移到黃鐵礦中培養，24h后產生大量CPS。在培養基中補充葡萄糖或半乳糖可以誘導細胞產生CPS，而酪蛋白氨基酸不能誘導產生CPS［9］。蛋白組學研究發現，acidithiobacillus thiooxidans生物膜中含有一種新的脂蛋白licanantase，該蛋白屬于OMP40類蛋白，能夠促使細胞吸附到礦物表面的疏水區域，參與電子傳遞，有利于細菌定植和氧化礦物［10］。以硫為能源培養 A．ferrooxidans細胞，蛋白組學技術分析表明，EPS中的蛋白質含有豐富的巰基和CXXC結構域，可以通過Pr-SH與硫元素結合，直接參與對硫的代謝。近年來，在多種微生物中發現一種類似菌毛的蛋白質細絲——納米線。納米線是生物膜的重要組分，具有獨特的胞外電子轉移能力。A．ferrooxidans的Ⅳ型菌毛（TFP）具有導電能力，電子經氧化還原蛋白之間的電子傳遞反應沿TFP傳導，在礦物、可溶性電子傳遞中間體和外膜細胞色素間形成電流，加快生物膜上電子傳遞速率，形成細胞表面和Fe（Ⅱ）氧化物之間的電子傳遞通路。TFP的結構域蛋白由保守氨基酸序列組成，有2個基因pilV和pilW編碼。pilV是吸附基因，而pilW是用于編碼TFP的主要蛋白質［11-14］。

浸礦微生物的胞外多聚物主要由中性糖、糖醛酸和脂肪酸組成，由于生長基質、菌種類型及培養時間不同，生物膜的組成和含量也不同［15］。由亞鐵或黃鐵礦培養的A．ferrooxidans和leptospirillum ferrooxidans等鐵氧化菌的EPS中普遍存在巖藻糖、鼠李糖、葡萄糖和糖醛酸；而以硫為能源培養的浸礦微生物，如A．thiooxidans的EPS中糖的含量相對較少，主要成分是葡萄糖，且未檢測到糖醛酸［15］。生物膜中脂類物質主要為脂多糖、脂肪酸和脂蛋白，脂多糖在培養中期較多，脂肪酸的主要成分包括二十二烷酸、十八烷酸和十六烷酸等［2-3］。此外，在含鐵能源培養的微生物胞外多聚物中檢測到三價鐵離子，糖醛酸等胞外多聚物通過絡合鐵離子影響界面浸出過程。分別以A．ferrooxidans、L．ferrooxidans和 L．ferriphilum氧化黃鐵礦，發現EPS中鐵含量與氧化活性成正比［16-18］。

2 生物膜的形成與礦物浸出

浸礦微生物能分泌各種胞外物質，通過形成生物膜吸附在礦物表面，形成一個10～100nm的反應空間，使礦物逐步溶解［18］。細菌生物膜增殖的程度及其吸附率與生物膜的活性緊密相關［16，19］。

用原子力顯微鏡、拉曼光譜和熒光標記技術對黃鐵礦浸出時生物膜的狀況的研究表明，浸礦微生物形成單層生物膜，培養初期細胞開始吸附到礦物表面，吸附力是弱的非共價作用力；浸出中期吸附的細胞數量達到最大值；后期隨著生物氧化時間增加，礦物表面生物膜逐漸減少。結果顯示，在黃鐵礦表面生物氧化S0的過程中，細菌分泌較多的EPS，而EPS緊密吸附在黃鐵礦表面，Fe（Ⅲ）通過接觸機制氧化礦物，這表明EPS在微生物和礦物表面相互作用中扮演重要角色［20-21］。

對黃銅礦表面及溶液中微生物的分布規律的研究表明：生物浸出前期，生物膜通過富集鐵離子氧化分解礦物；浸出中期，當生物膜的量達到最大時，溶液中的游離微生物大量生長，促進鐵的氧化還原和可溶性硫的氧化；浸出后期，黃鉀鐵礬的形成抑制礦物表面微生物和營養物的流動及相應的反 應，從而阻礙黃銅礦的浸 出［22-25］。N．A．Olivera等［26］首次利用二維不均勻的生物膜模型研究生物浸出時的生化反應，結果表明，隨浸出的進行，礦物表面形成不滲透固體層，這個固體鈍化層阻礙 O2、CO2、Cu2＋和Fe2＋的擴散，而這些物質決定細菌和礦物反應的動力學。化能自養微生物形成的生物膜能夠通過形成腐蝕坑、硫溶解增加固體層孔隙率來延遲鈍化。與較厚的生物膜相比，平坦的生物膜更有利于生物浸出，因它更利于硫的溶解而不是鐵的氧化。

在生物浸礦過程中，礦物表面的形態轉化誘導生物膜的結構變化。J．V．García-Meza等［27］利用拉曼光譜、EPS生化分析和熒光顯像技術研究了A．thiooxidans氧化塊狀黃銅礦電極（massive chalcopyrite electrodes，MCE）過程中礦物表面Sn2-／S0的動態變化和生物膜的轉變。最初，MCE的表面包含具有活性的二級Sn2-和S0的混合物，微生物形成厚的單層生物膜。隨著細菌對S0／Sn2-的不斷氧化，礦物表面形成穩定的CuS和S0簇狀物，而生物膜中脂質和蛋白質逐漸增多，降低了細胞和礦物表面的界面張力，克服細胞與礦物表面間的屏障，有利于細胞和礦物直接接觸進行氧化反應，這為后期生物膜的分層提供了有利條件。

3 浸礦微生物生物膜的調控

生物膜是細胞間相互協調，以多細胞群體形式組成的復雜結構，它的形成受環境因子、細胞密度和信號分子的調控。

群體感應（quorum sensing，QS）是依賴細胞密度的一種細胞間的信號機制，由可擴散的自誘導物（autoinducers，AIs）介導細胞間的信號傳遞，可與影響生物膜結構的因素相互作用，影響生物膜的形成和功能。薄層色譜法分析結果表明，A．ferrooxidans和A．thiooxidans菌株都能夠產生?；呓z氨酸內酯 （acyl-homoserine lactone，AHL）信號分子，但L．ferrooxidans菌株不能。AHL具有不同長度的?；?，AHL混合物抑制細胞吸附到黃鐵礦等礦物表面，而具有長酰基鏈（12或14個碳）的單一信號分子可以增強吸附。這些發現有利于控制酸性礦山廢水（AMD）污染和改善生物浸礦過程，為研究生物冶金開拓了新的視角［28］。

與其他革蘭氏陰性菌一樣，A．ferrooxidans的官能團AI-1型QS系統由4個分子元件組成：AHL合成酶（由AfeI編碼），結合信號分子的轉錄調控因子（AfeR），二元配合物［AfeR-AHL］作用的Afe-盒，不同的高絲氨酸內酯（AHL）信號分子［29］。當細菌密度或營養條件變化時，AfeI就會合成AHL信號分子，這些分子具有不同的C-3基團（氧或羥基），其?；溨刑荚訑禐?～16個。AfeR基因和群體感應調節蛋白能夠識別具有不同長度酰基鏈的信號分子。信號分子隨細菌數目的增加而增加，達到一定濃度后，細菌細胞內外就會感知并引發一系列反應，調節生物膜的形成［30-31］。此外，相比于鐵培養的細胞，在高能固體底物如硫中生長的細胞，AfeI基因具有更高的轉錄水平［32-33］。

除 AHL信號分子外，A．ferrooxidans ATCC 23270具有編碼第二信使環二鳥苷酸（c-di-GMP）相關的酶系，調控生物膜的形成和胞外多糖的生成［34］。環二鳥苷酸（c-di-GMP）在細胞中的量取決于二鳥苷酸環化酶（DGCS，具有GGDEF結構域）和磷酸二酯酶（PDE，具有EAL或 HD-GYP結構域）的活性。A．ferrooxidans ATCC 23270的基因組序列分析確定了5個編碼DGC和PDE——類似蛋白的開放閱讀框：其中，AFE＿0053，AFE＿1360，AFE＿1373和 AFE＿1379具有GGDEF和EAL結構域，編碼雙功能蛋白；AFE＿1852只有一個EAL結構域［35］。A．ferrooxidans生物膜細胞中c-di-GMP的量明顯高于浮游細胞，其浸礦效率也更高。此外，與亞鐵中浮游細胞相比，吸附在硫鐵礦表面的細胞的c-di-GMP水平更高，說明具有GGDEF／EAL結構域的蛋白在鐵氧化菌的生物膜中優先表達［36］。

4 展望

生物膜是微生物營造自身生長微環境的主要物質，在完善生物膜組分的基礎上，深入研究各種浸礦微生物生物膜的特性、生物膜形成與細胞結構變化、細胞代謝過程及浸礦環境參數之間的動態聯系，可逐步了解微生物浸礦規律。隨著生物技術的快速發展，在基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等水平上研究生物膜的形成與調控機制，建立有效消除鈍化膜的關鍵技術，對提高生物冶金細菌浸出速率和金屬回收率有重要意義。

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