絕經前后三陰性乳腺癌患者差異蛋白分析

梁金龍+++張健莉+++羅守娟+等

[摘要] 目的 應用iTRAQ技術分析絕經前后三陰性乳腺癌組織差異蛋白的表達情況，旨在探討絕經對三陰性乳腺癌發生的影響。 方法 選擇絕經前及絕經后各8例經病理確診的三陰性乳腺癌患者，應用iTRAQ技術分析差異蛋白顯著性功能、差異蛋白pathway并進行差異蛋白驗證。 結果 （1）絕經前差異蛋白相互作用組較集中，而絕經后的差異蛋白較多，且分布較散。（2）絕經前癌組織的差異蛋白存在于5種差異顯著途徑中；絕經后癌組織的差異蛋白存在于15種差異顯著途徑中。（3）與癌旁組織相比，絕經前共有214種顯著差異蛋白，絕經后共有360種顯著差異蛋白。絕經前的三陰性乳腺癌組織中上調蛋白81種，下調蛋白133種，絕經后上調蛋白157種類，下調203種。 結論 利用iTRAQ技術發現，絕經前后三陰性乳腺癌患者差異蛋白表達具有一定的特殊性，說明不同雌激素環境下三陰性乳腺癌可能存在不同發病機制，可能成為治療TNBC的新靶點。

[關鍵詞] 三陰性乳腺癌；絕經前后； iTRAQ技術；差異蛋白

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）02-0001-04

三陰性乳腺癌（TNBC）是指孕激素受體（progesterone receptor，PR）、雌激素受體（estrogen receptor，ER）和人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）均為陰性表達的乳腺癌，其多發于初潮及足月懷孕年齡早、哺乳期短，特別是絕經前的婦女[1]。目前手術、化療及新輔助化療和靶向治療為常用治療TNBC方法。其中分子靶向治療以腫瘤細胞的特征性改變為作用靶點，在發揮更強的抗腫瘤作用的同時減少對正常細胞的毒副作用。目前TNBC治療靶點的篩查工作已取得了一定的研究進展，其中差異蛋白質組學的方法被認為是目前篩選TNBC臨床治療靶點最為有效的研究方法之一。差異蛋白質組學的方法主要包括雙向凝膠電泳、雙向熒光差異凝膠電泳、高效液相色譜技術、應用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術等分離技術及質譜鑒定技術[2]。近年來人們對iTRAQ技術的應用日漸開展起來，然而將iTRAQ技術應用于三陰性乳腺癌機制研究及靶向位點的探討至今仍較少。本研究以絕經前和絕經后三陰性乳腺癌患者癌組織和癌旁正常組織為實驗材料，利用iTRAQ技術分析絕經前和絕經后三陰性乳腺癌和癌旁正常組織蛋白差異表達譜，進而分析絕經前和絕經后差異蛋白的特異性，旨在探討絕經對三陰性乳腺癌發生產生的影響，從而為三陰性乳腺癌的治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013年1月～2014年1月間我院收治的絕經前及絕經后各8例經病理確診的三陰性乳腺癌患者，病理類型均為導管腺癌。絕經前8例TNBC患者的年齡范圍為40～53歲。絕經后8例TNBC患者的年齡范圍為59～81歲。16例三陰性乳腺癌患者的病例資料見表1。

1.2 實驗過程

1.2.1 SDS-PAGE （1）組織標本處理：取術后新鮮的乳腺癌組織及距腫瘤5 cm以上的癌旁正常乳腺組織，切成小塊，稱重，分裝，置-80℃的低溫冰箱中保存備用。（2）總蛋白制備：①取50 μg低溫冷凍的樣品置于液氮預冷的研缽中，邊加入液氮邊研磨，直至樣品呈現白色粉末狀，收集到1.5 mL的EP管中。②加入500 μL LS，振蕩器混勻，超聲波破碎，重復3次，每次間隔3 min。③置冰上1 h，并間歇震蕩。④4℃，15 000 rpm離心30 min，重復2次，樣品分層后用移液器小心地將中層清液吸出放入1.5 mL EP管中。⑤向中清液加入丙酮/甲醛沉淀液，冰上沉淀2 h。⑥4℃，15 000 rpm離心20 min，棄上清，加入1 mL 100%丙酮，置于-20℃冰箱中沉淀1 h。⑦加入80%丙酮1 mL，-20℃冰箱中沉淀1 h，4℃，15 000 rpm離心15 min，留取沉淀，在空氣中晾干。⑧將250 μL 加入RS晾干沉淀，渦旋振蕩器上混勻，30℃金屬浴中孵育1 h。⑨4℃，15 000 rpm離心10 min，留取上清，即為組織總蛋白溶液。（3）總蛋白濃度測定：①準備兩組8個1.5 mL離心管，每管各加入0、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20 μL 0.5 mg/mL牛血清白蛋白，再分別加入20、15、12.5、10、 7.5、5、2.5、0 μL蛋白溶解液，再加入80 μL 0.15 mmol/L NaCl，以1號管不含牛血清白蛋白的作空白對照。②每管各加入1 mL考馬斯亮藍染料溶液。③比色測OD595。（4）SDS-PAGE：①準備SDS-PAGE凝膠。②將樣品與SDS樣品緩沖液混合，同樣準備蛋白質分子量標準物。③上樣：取15 μL蛋白樣品上樣，12% SDS-PAGE電泳，電極緩沖液為Tris-甘氨酸電泳緩沖液。按次序上樣，一定安排已知分子量的標準物。④電泳。⑤取下凝膠，考馬斯亮藍或銀染色染色觀察分析。

1.2.2 酶解及iTRAQ標記 （1）樣品處理：每組取120 μg樣品于30 μL SDT溶液，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入200 μL UA溶液混勻，轉入30 kd超濾離心管，離心14000 g 15 min。加入200 μL UA溶液，離心14000 g 15 min，棄濾液。加入100 μL IAA，600 rpm振蕩1 min，避光室溫30 min，離心14000 g 10 min。加入100 μL UA溶液，離心14000 g 10 min重復2次。加入100 μL 25 mM NH4HCO3，離心14000 g 10 min重復2次。加入40 μL Trypsin buffer 600 rpm振蕩1 min，37℃ 16～18 h。換新收集管，離心14000 g 10 min，收集濾液。（2）蛋白質含量測定：同1.2.1。（3）同位素標記：從每組取等量肽段（約100 μg），按照試劑盒說明書進行標記。

1.2.3 肽段的分離及鑒定 分別進行強陽離子交換層析分級分離、毛細管高效液相色譜分離、ESI質譜鑒定。

1.3 數據分析及處理

（1）質譜數據分析：原始文件用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量數據，并用Sequest軟件鑒定多肽分子。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder軟件分析，依據同位素報告基因的相對含量進行蛋白質定量。（2）生物信息學分析：分析差異蛋白在Gene Ontology數據庫中的分布狀況，利用Cluster軟件進行蛋白功能注釋，基于KEGG數據庫對差異蛋白基因進行通路注釋，得到差異蛋白基因所參與的所有的通路，利用Fisher精確檢驗計算每個通路的顯著性水平，并對多重假設檢驗的結果進行校正并獲得誤判率，從而篩選出差異基因參與的顯著通路[3]。

2 結果

2.1 絕經前后的TNBC患者差異蛋白顯著性功能分析

絕經前在已鑒定的差異量2倍以上的214種蛋白中，具有Go注釋的有89種，其中12種蛋白參與小分子代謝，10種蛋白參與細胞粘附，7種參與炎癥反應，7種參與調節基因表達。見封三圖1。絕經后已鑒定的差異量2倍以上的360種蛋白中，具有Go注釋的有156種，其中24種蛋白參與小分子代謝，12種蛋白參與細胞粘附，8種參與炎癥反應，15種參與調節基因表達，12種具有信號轉導功能，3種參與凋亡反應，17種發揮轉運功能，20種參與血液凝固，2種參與細胞內蛋白代謝過程，見封三圖2。將絕經前和絕經后顯著差異蛋白整理繪制相互作用圖譜，發現絕經前差異蛋白相互作用組較集中，而絕經后的差異蛋白較多，且分布較散。見封三圖3、4。

2.2 絕經前后的TNBC患者差異蛋白Pathway分析

基于KEGG數據庫對差異基因進行Pathway注釋，得到差異基因所參與的所有途徑。絕經前有ECM-受體相互作用、蛋白質消化吸收、腎素-血管緊張素系統、互補及凝固級聯反應和聚集粘附這5種途徑為差異基因顯著參與的途徑。絕經后具有15種特異的Pathway，差異蛋白參與的途徑包括粘著斑、在內質網內的蛋白質加工、丙酮酸的新陳代謝、PPAR信號通路、谷胱甘肽新陳代謝、葡萄球菌感染、核糖體、糖酵解、糖異生、補體、苯丙氨酸代謝、吞噬作用等。

2.3 絕經前后的TNBC患者差異蛋白驗證分析

采用iTRAQ技術不僅可發現胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，并可檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、小于10 kD或大于200 kD的蛋白。結果顯示，在絕經前后兩組共鑒定1254種蛋白質，其中1243種有定量信息。選擇表達量差異2倍以上的作為顯著差異蛋白，與乳腺癌旁組織相比，絕經前（premenopause）共有214種顯著差異蛋白，絕經后（Hpost-menopauseH）共有360種顯著差異蛋白（表2）。

表2 絕經前后TNBC患者顯著差異蛋白（與乳腺癌旁組織相比）（個）

3 討論

三陰性乳腺癌其發病及致病機制比較復雜，激素環境一直被認為是TNBC致病潛在重要的影響因子之一[7]。經期是激素變化的顯著階段，絕經前與絕經后體內激素發生很大的變化，其中雌激素越多，絕經女性患某些乳腺癌的幾率相對越大[4]。目前，尚無絕經與TNBC關系的研究報道，是否絕經對三陰性乳腺癌發生具有影響，絕經前后不同激素水平條件下三陰性乳腺癌發生的機制是否存在差異，至今未知。

三陰性乳腺癌的治療目前還沒有一個明確的、行之有效的靶向治療單劑，其中分子靶向治療是目前治療癌癥的有效手段，且TNBC的治療靶點的篩查工作已取得了一定的研究進展，其中差異蛋白質組學的方法被認為目前篩選臨床治療靶點最為有效的研究方法之一[5]。差異蛋白質組學的方法主要包括雙向凝膠電泳、雙向熒光差異凝膠電泳、高效液相色譜技術、應用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術等分離技術及質譜鑒定技術。由于凝膠電泳仍具有低靈敏度、無法檢測低豐度蛋白的局限，因此近期人們比較關注同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術的應用[6-8]。與凝膠為基礎的定量方法比較，iTRAQ技術可捕獲全蛋白、且無需凝膠電泳、同時可進行多樣品分析，從而成為研究三陰性乳腺癌靶向位點的有力手段之一[9，10]。然而iTRAQ技術應用到三陰性乳腺癌機制研究及靶向位點的探索至今仍較少。iTRAQ技術是采用4種或8種同位素的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，進行串聯質譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對含量或絕對含量。Leroi D等[11]采用iTRAQ技術探討子宮內膜癌的差異蛋白，并發現chaperonin 10，pyruvate kinase M1 or M2 isozyme，calgizzarin等9種蛋白可以作為潛在的靶向治療位點。

本研究應用iTRAQ技術結合2D LC-MS/MS，在絕經前和絕經后兩組中共鑒定1254種蛋白質，其中1243種有定量信息。選擇表達量差異2倍以上的作為顯著差異蛋白，與癌旁組織相比，絕經前共有214種顯著差異蛋白，絕經后共有360種顯著差異蛋白。其中與癌旁組織相比，絕經前的三陰性乳腺癌組織中上調蛋白81種，下調蛋白133種，絕經后上調蛋白157種類，下調203種，絕經前后差異蛋白表達并不完全一致，說明絕經前后TNBC患者的蛋白表達情況具有一定的差異性及特殊性。在這些差異表達的蛋白中，有一些功能尚不十分清楚，而有一些與腫瘤密切相關。且本研究將絕經前和絕經后顯著差異蛋白整理繪制相互作用圖譜（封三圖3、4），結果顯示，絕經前差異蛋白相互作用組較集中，而絕經后的差異蛋白較多，且分布較散。同時我們對絕經前后的TNBC患者差異蛋白的通路分析顯示：絕經前癌組織的差異蛋白存在于5種差異顯著途徑中；絕經后癌組織的差異蛋白存在于15種差異顯著途徑中。絕經前后的TNBC患者共同存在的差異蛋白主要體現在三條顯著途徑，分別為ECM-受體相互作用途經、蛋白質消化吸收、腎素-血管緊張素系統，而絕經后也有獨特的差異顯著通路，推測以絕經為界限，絕經前和絕經后的TNBC具有不同的致病機制[12]。共同的通路是三陰性乳腺癌的共性致病調控途徑，而絕經后仍存在12種調控途徑，包括粘著斑、在內質網內的蛋白質加工、丙酮酸的新陳代謝、PPAR信號通路、谷胱甘肽新陳代謝、葡萄球菌感染、核糖體、糖酵解、糖異生、補體、苯丙氨酸代謝、吞噬作用等相關蛋白，具有一定特性，因此根據絕經前后致病機制的不同，可以選擇不同的治療方案，為針對性治療三陰性乳腺癌指明方向。

總之，本研究中我們應用iTRAQ技術對絕經前后三陰性乳腺癌及癌旁正常組織的蛋白質組進行比較分析，確定了差異表達的蛋白，并對這些蛋白進行了功能分析，確定了這些差異蛋白顯著參與的信號轉導途徑，但這些差異蛋白在絕經前后三陰性乳腺癌具體通過什么機制、如何發揮作用還需要繼續進行大樣本進一步深入地研究。

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（收稿日期：2014-10-30）