金針菇菇腳蛋白質的提取

朱麗萍，陸瑤，胡國元*，劉啟燕

1.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074；2.武漢如意食用菌生物高科技有限公司，湖北 武漢 430000

金針菇菇腳蛋白質的提取

朱麗萍1，陸瑤1，胡國元1*，劉啟燕2

1.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074；2.武漢如意食用菌生物高科技有限公司，湖北 武漢 430000

為了更好地利用金針菇加工副產物，采用單因素實驗法探討了液料比、氫氧化鈉濃度、提取溫度、提取時間、提取次數對金針菇菇腳蛋白質提取率的影響，結果表明，對金針菇菇腳蛋白質提取率影響較大的三個因子是液料比、提取溫度和提取時間.采用響應面法對這三個因子的三個水平進行分析，結果顯示三因子對金針菇菇腳蛋白質提取率的影響由大到小小依次為液料比、提取溫度、提取時間，其中對蛋白質提取率有顯著影響的是提取溫度和液料比的交互作用，其他項的交互作用對蛋白質提取率無顯著影響.優化的堿法提取金針菇菇腳蛋白質工藝條件是：液料比20∶1 mL／g、氫氧化鈉質量濃度為0．5 g每100 mL、提取溫度61℃、提取時間2 h、提取次數2次，金針菇菇腳蛋白質堿法提取率最高值達到12.07%.

金針菇菇腳；蛋白質；堿提；響應面

0 引言

現今金針菇工廠化栽培規模逐漸擴大，如何有效含有多種功能性蛋白的利用金針菇菇腳等副產物成為企業的關注重點.堿溶酸沉法、酶解法、超聲波萃取法［1］、反膠束法［2］、鹽溶法［3］和膜分離法［4］是植物蛋白提取的主要方法.已有文獻報導通過正交實驗確定堿法提金針菇菇腳蛋白質的最佳條件［5］.但是利用響應面法優化金針菇菇腳蛋白提取工藝的報道少見，在此背景下，本實驗以金針菇工廠加工剩余的金針菇菇腳作原料，探討對金針菇菇腳蛋白提取率有較顯著影響的因素，再利用響應曲面法對提取工藝進行優化，獲得最優的提取參數，以期能充分利用金針菇的副產物，降低其對環境的危害的同時，提高農戶和企業的經濟效益.

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 原料金針菇菇腳（菌柄基部1～3 cm）由武漢如意食用菌生物高科技有限公司提供.

1.1.2 試劑氫氧化鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）、考馬斯亮藍G－250（分析純）、磷酸（分析純）、鹽酸（分析純），皆為市售.

1.2 方法

1.2.1 實驗材料的預處理將新鮮金針菇菇腳晾曬至半干后，放于烘箱中60℃鼓風烘干，然后經高速萬能粉碎機粉碎，d＜0．15 mm篩分，制得金針菇菇腳粉末，置于干燥器中保存備用.

1.2.2 菇腳蛋白質的提取取制備好的金針菇菇腳粉末1 g置于錐形瓶中，加入一定質量濃度的NaOH溶液，于一定溫度下水浴浸提一段時間后，經布氏漏斗加壓抽濾，收集濾液.將濾渣堿液重復提取1次，合并2次提取液即為菇腳蛋白質提取液.

1.2.3 單因素試驗設計分別測定液料比（1∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g）、NaOH濃度（0．2、0．3、0．4、0．5、0．6 g/100 mL）、提取溫度（40、50、60、70、80℃）、提取時間（1、2、3、4、5 h）、提取次數（1、2、3、4次）對金針菇菇腳蛋白質提取率的影響.

1.2.4 響應面優化法根據單因子試驗的結果，選取對實驗有較顯著影響的因素和水平，由Box－Behnken設計出分析因素與水平表（表1），再運用Design Export 8．0分析實驗結果.各因素的試驗水平及編碼列于表1.其中A、B、C分別表示提取溫度（℃）、提取時間（min）及液料比（mL／g）.

1.2.5 蛋白質含量的測定以牛血清蛋白為標準品，采用考馬斯亮藍法［6］測定蛋白質含量.

1.2.6 蛋白提取率的計算按照1．2．5中方法測定提取液的吸光度值，并根據標準曲線方程計算出稀釋1 000倍后提取液中蛋白的質量.金針菇菇腳蛋白提取率計算公式如下：

表1 堿提法提取金針菇菇腳蛋白響應面分析因素與水平表Table 1 Coded variables and their coded levels in RSM

2 結果和分析

2.1 菇腳蛋白的單因子實驗結果

2.1.1 菇腳蛋白質提取率受液料比的影響確定NaOH溶液質量濃度＝0．5 g/100 mL，提取溫度為70℃，提取時間2 h，提取次數2次，在此條件下測定不同液料比對金針菇菇腳蛋白質的提取率.由圖1可以看出，當液料比增加時，蛋白質的提取率呈增加趨勢.

圖1 金針菇菇腳蛋白質提取率受液料比的影響Fig.1 Effect of liquid－solid ratio on extracting rate of F.velutipes’stipe protein

2.1.2 菇腳蛋白質提取率受NaOH濃度的影響確定液料比為20∶1，提取溫度70℃，浸提時間2 h，提取次數2次，在此條件下，測定不同NaOH濃度下菇腳蛋白質的提取率.實驗結果顯示，NaOH質量濃度為0.5g/100mL之前，蛋白質的提取率隨著NaOH濃度的增加而增加；NaOH質量濃度0.5 g/ 100 mL之后，隨著NaOH濃度的增加，提取率反而有所下降（圖2）.

2.1.3 菇腳蛋白質提取率受溫度的影響在液料比20∶1，NaOH質量濃度為0．5 g／100 mL，浸提時間為2 h，提取次數2次條件下，測定不同提取溫度對蛋白提取率的影響試驗結果顯示，當提取溫度增加時，蛋白質的提取率呈上升趨勢.在溫度為60℃之前，蛋白質的提取率增加的幅度較大；溫度為60℃之后，提取率增加的幅度開始降低（圖3）.

圖2 金針菇菇腳蛋白質提取率受NaOH質量濃度的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on extracting rate of F.velutipes’stipe protein

圖3 金針菇菇腳蛋白質提取率受溫度的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on extracting rate of F.velutipes’stipe protein

2.1.4 菇腳蛋白質提取率受時間的影響在液料比20∶1，每100 mL為NaOH質量為0.5 g，提取溫度為70℃，提取次數2次條件下，測定不同提取時間下菇腳蛋白提取率的變化.結果顯示，提取時間越長，蛋白質提取率增長趨勢越緩慢（圖4）.

圖4 金針菇菇腳蛋白質提取率受時間的影響Fig.4 Effect of time on extracting rate of F.velutipes’stipe protein

2.1.5 菇腳蛋白質提取率受次數的影響在液料比20 mL／g，NaOH質量濃度為每100 mL 0.5 g，提取溫度為70℃，浸提時間為2 h條件下，測定不同提取次數下菇腳蛋白提取率的變化.結果表明，當提取次數增加，蛋白質的提取率呈先增加后趨于平緩的趨勢（圖5）.

2.2 響應面實驗結果

圖5 金針菇菇腳蛋白質提取率受次數的影響Fig.5 Effect of extracting times on extraction rate of F.velutipes’stipe protein

根據單因素實驗結果不顯著因素條件確定提取液NaOH質量濃度、提取次數分別為，NaOH為0.5 g每100 mL、提取次數2次.選取有顯著影響的液料比、提取溫度、提取時間3個因素為響應面優化法的因素水平，金針菇菇腳蛋白質提取率為因變響應值（y），響應曲面實驗設計及其結果見下表2.

實驗數據運用Design Expert 8．0軟件分析，建立金針菇菇腳蛋白提取率與提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）3個因素的數學回歸模型：

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table.2 Experimental designs and results of Box-Behnken

Y=+2.160+0.400A+0.033B+0.440C+0.035AB-0.300AC-0.017BC-14.80A2-2.350B2-2.800C2

該方程中的系數表示各個因素對實驗結果的影響程度，由此方程可以預測得到各個不同條件組合下金針菇菇腳蛋白的提取率.

2.3 回歸模型的方差分析

對所得回歸模型進行方差分析，結果如下表3所示.

2.3.1 單因素對實驗結果的影響通過方差分析表，由F檢驗，可以得出A－提取溫度、C－液料比對金針菇菇腳蛋白提取率的影響均為極顯著，而B－提取時間對金針菇菇腳蛋白提取率的影響不那么顯著.三個因素對提取質量的影響的顯著性依次是：C＞A＞B，即液料比＞提取溫度＞提取時間.

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

2.3.2 交互項對實驗結果的影響在響應面的分析中，由等高線的圖形和顏色可以看出交互作用的顯著與否.圖形愈橢圓體現出交互作用愈強，愈趨向圓形就愈弱.再來分析圖的顏色，由藍變紅則提取率從小變大，變的愈快顯示坡度愈大，表示影響實驗結果更顯著，等高線代表的是在一條線上所有的組合方案得到的蛋白質提取率都一樣.

圖6～8表明，提取溫度（A）和液料比（C）之間的交互作用顯著（p＜0．05），表現為等高線呈橢圓形，顏色變化更為分明.提取溫度（A）和提取時間（B）、提取時間（B）和液料比（C）相對而言交互作用不顯著.

圖7是在提取時間為2 h時，提取溫度（A）和液料比（C）交互作用對菇腳蛋白提取率影響的曲面圖和等高線圖.由圖可知，隨提取溫度的增加，菇腳蛋白質的提取率變化為先增加后降低.當液料比較低時，得率變化很小，表現為響應曲面平滑，說明提取溫度對菇腳蛋白提取率影響不顯著；而當液料比逐漸增加這種變化趨勢較為明顯，表現為響應曲面變陡，說明提取時間對菇腳蛋白提取率影響顯著.在液料比為20∶1時提取率達到最高；當液料比進一步增加，這種變化趨勢開始減緩，響應曲面表現為平滑.當提取溫度漸漸上升，液料比對提取率的影響呈現相似的效應.等高圖的中心位置即提取溫度60℃、液料比20∶1是提取率的較高點.

圖6 對蛋白提取率受時間和溫度交互作用的影響Fig.6 The impact of temperature and time on extraction rate of protein

圖7 蛋白提取率受溫度和液料比交互作用的影響Fig.7 The impact of temperature and liquid－solid ratio on extraction rate of protein

圖8 蛋白提取率受時間和液料比交互作用的影響Fig.8 The impact of time and liquid－solid ratio on extraction rate of protein

2.3.3 響應面模型評估從表4可信度分析結果可知，R2（Pred R－Square）達到0.936 7，表明新觀測值的好壞可以較好地被此模型所預測.

R2（R－Square）達到0．995 6，表明實驗所試驗點的適配度為99．56%，模型擬合度很高，實驗誤差較小.

修正R2（Adj R－Square）為0．987 7，表明98．77%的試驗數據變異性可以被解釋.

同時R2（R－Square）與修正R2（Adj R－Square）兩值接近，更說明建立的模型擬合性好、可靠.

Adeq Precision＞4表明該模型具有足夠分辨力，這個模型可以用于實踐.

以上幾個重要的評估模型好壞的參數均說明本模型擬合較好，適合對金針菇菇腳蛋白提取工藝進行分析和預測.

表4 回歸模型的評估Table 4 The assessment of the regression model

2.3.4 響應面驗證試驗根據回歸方程：

可以得到提取的最優條件.由回歸方程可得：

將式（1）、（2）、（3）聯立方程組，解得A＝0．130，B＝0．008，C＝0．068，將編碼值轉換成實際條件得到提取溫度＝61．30℃，提取時間＝2．01 h，液料比為20．34 mL／g.將上述優化的提取條件進行菇腳蛋白質的提取實驗，來驗證響應面模型所得數據的可靠性.但為實際操作方便，將提取金針菇菇腳蛋白的最佳工藝條件修正為：提取溫度61℃，提取時間2h，液料比20 mL／g.在此條件下蛋白質實測提取率為12．07%，而由回歸模型所預測的理論提取率為12．20%，理論預測值比實際測定值高1．07%.顯示各個因素同菇腳蛋白質提取率之間的關系可以很好的被該模型所預測.以上可以說明，由響應曲面分析法優化得到了確信可靠的菇腳提取參數，且得到了適配性良好的回歸模型.

3 結語

本研究的目的是對金針菇菇腳蛋白的提取工藝進行優化，通過單因素實驗對液料比、NaOH濃度、浸提溫度、浸提時間和浸提次數進行分析，得到單因素實驗下菇腳蛋白提取率的變化趨勢圖.在此結果上選擇有顯著影響的三個因素提取溫度、提取時間和液料比，運用響應面分析法進行進一步研究.

通過以提取溫度（50～70℃）、提取時間（1～3 h）、液料比（15～25 mL／g）作為提取的因素和水平，用響應面法進行三因素三水平的優化設計實驗.通過借助Design Export 8．0的分析我們可以得到以下結論：

a．各個因素對菇腳蛋白提取率的影響為：液料比＞提取溫度＞提取時間.

b.提取溫度和液料比的交互作用對菇腳蛋白質提取率有顯著影響，其他任意兩項的交互作用對菇腳蛋白質提取率無明顯影響.

c.實驗優化的提取菇腳蛋白的提取工藝條件是：液料比20∶1 mL/g、NaOH質量濃度為0．5 g/ 100 mL、提取溫度61℃、提取時間2 h、提取次數為2次，理論上最佳提取率為12．20%.在此條件下菇腳蛋白的實測提取率為12．07%，誤差在可接受范圍內.說明本模型擬合很好，為分析和預測金針菇菇腳蛋白質的提取工藝提供了理論依據.

致謝

感謝武漢工程大學研究生處對本研究提供的資助！

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Extraction technology of protein from base of Flammulina velutipes

ZHU Li－ping1，LU Yao1，HU Guo－yuan1，LIU Qi－yan2
1.School of Chemical Engineering＆Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；2.Wuhan Wishful Edible Fungi Bio－Tech Co．，Ltd．，Wuhan 430000，China

To use the processing byproducts ofFlammulina velutipesbetter，the effects of the ratio of water to material，the extraction temperature，the extraction time，the extraction times on the extraction ratio of protein from the base of F．velutipes’stipe were studied by single factor experiment．The result shows that the ratio of water to material，the extraction temperature and the extraction time have impacts on the extraction ratio of protein．Then three levels of the three factors were analyzed by response surface method．The result show that the size order of factors’influence on the extraction ratio of the protein from the base ofF．velutipes’stipe is：the ratio of water to material＞the extraction temperature＞the extraction time，in which the interaction of the extraction temperature and the ratio of water to material has a significant effect on the extraction ratio of the protein and the interaction of the other factors has little impact．The optimal conditions of extracting protein from the base ofF．velutipes’stipe are the ratio of water to material of 20∶1 mL／g，the sodium hydrate concentration of 0．5 g／100 mL，the extraction temperature of 61℃，the extraction time of 2 h，and the extraction times of 2 times；the extraction ratio of the protein reaches 12．07%under the condition．

the base ofFlammulina velutipes’stipe；protein；NaOH extraction；the response surface

TQ936.1

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.05.005

1674－2869（2015）06－0021－06

本文編輯：張瑞

2015－04－09

武漢工程大學第六屆研究生教育創新基金（CX2014016）

朱麗萍（1990－），女，湖北荊州人，碩士研究生.研究方向：微生物發酵.*通信聯系人