煉油廢水中異養硝化-好氧反硝化菌的篩選

武文麗，顏家保，紀南南，曹曉詩，胡茜茜，吳 優

（武漢科技大學 化學工程與技術學院，湖北 武漢 430081）

煉油廢水中異養硝化-好氧反硝化菌的篩選

武文麗，顏家保，紀南南，曹曉詩，胡茜茜，吳 優

（武漢科技大學 化學工程與技術學院，湖北 武漢 430081）

從煉油廢水活性污泥中篩選出一株具有異養硝化-好氧反硝化能力的菌株WY6。對篩選菌株進行了生理生化實驗和菌種鑒定，考察了碳源種類、培養基的m（C）∶m（N）、培養溫度、初始pH及接種量對菌株硝化性能的影響；并對其NH3-N去除性能進行了考察。經鑒定，該菌為鮑曼不動桿菌，適宜的培養條件為：以丁二酸鈉為碳源、培養溫度30℃、初始pH 9.0、m（C）∶m（N）=10、接種量2.0%。在此條件下培養20 h，可將NH3-N質量濃度由245.46 mg/L降至9.71 mg/L，平均NH3-N去除速率為11.79 mg/（L·h）。WY6菌可在32 h內將實際煉油廢水的NH3-N質量濃度由初始時的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率達98.4%，表現出良好的應用前景。

煉油廢水；氨氮；異養硝化-好氧反硝化；菌種篩選

煉油廢水含有烴類化合物及其衍生物、酚類、雜環化合物、硫化物和氨氮等多種污染物，廢水量大，組分復雜，難降解有機物多，COD含量較高［1］。煉油廢水一般采用隔油—氣浮—生化的處理工藝［2］，COD去除效果較好，但廢水中NH3-N的脫除效果常常不穩定，生化過程硝化率低，造成生化后出水ρ（NH3-N）超標，不得不增加生物接觸氧化池和生物曝氣濾池等裝置進一步處理，提高了廢水的處理成本。煉油廢水生物處理系統的硝化率較低有多方面原因，最主要的可能是某些毒性有機物對自養硝化菌的抑制。而異養硝化菌能利用有機碳源，可消除有機物的抑制作用，從而提高煉油廢水的硝化效果，并達到同時脫碳脫氮的目的。

本工作從煉油廢水生物處理活性污泥中分離得到異養硝化-好氧反硝化高效菌，對篩選菌株進行了生理生化實驗和菌種鑒定，考察了碳源種類、培養基的m（C）∶m（N）、培養溫度、初始pH及接種量對菌株硝化性能的影響；并對其NH3-N去除性能進行了考察，旨在為煉油廢水的新型生物脫氮技術提供依據。

1 實驗方法

1.1 材料和儀器

活性污泥：取自中國石化武漢分公司煉油廢水生化處理裝置。

LB培養基：酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蛋白胨10 g，pH=7.1～7.5，加蒸餾水定容至1 L。

異養硝化培養基：丁二酸鈉9.54 g，Na2HPO4·12H2O 8.0 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41.0 g，MgSO40.1 g，FeSO40.01 g，微量元素儲備液2 mL，pH=7.0～7.3，用蒸餾水定容至1 L。

微量元素儲備液：組成見文獻［3］。

反硝化培養基：用0.15 g KNO3替代（NH4）2SO4，其余組分同異養硝化培養基。

實際廢水：中國石化武漢分公司排水車間氣浮隔油后的煉油廢水，COD=600～800 mg/L，ρ（NH3-N）=60～80 mg/L，pH=8～9。

所用試劑除酵母提取物、蛋白胨外，其余均為分析純。

SPX-250B-Z型生化培養箱：上海博訊實業有限公司；QYC21型恒溫搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；752N型紫外-可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；1-14型小型離心機：德國SIGMA公司。SA3500-85型雙目顯微鏡：北京泰克儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 異養硝化-好氧反硝化菌的富集和篩選

取少量活性污泥接種于LB培養基中活化，然后轉接至異養硝化培養基中多次馴化，對馴化后的菌液進行梯度稀釋，采用平板劃線法進行純化，得到異養硝化菌株；對篩選出的菌株進行硝化性能測試，將硝化能力較好的菌株再接種至好氧反硝化培養基中多次馴化，再經分離純化得到同時具有異養硝化和好氧反硝化能力的菌株。

1.2.2 菌種鑒定

選取篩選得到的異養硝化-好氧反硝化性能最好的一株細菌作為高效菌，進行菌種鑒定和特性研究：依據《常見細菌系統鑒定手冊》［4］進行形態學觀察和生理生化試驗；用溶菌酶-CTAB-蛋白酶K法［5］提取DNA，委托北京鼎國生物技術有限公司進行16S rDNA序列分析。

1.2.3 培養條件的選擇

將篩選所得高效菌接入LB培養基中，在培養溫度30 ℃、搖床轉速150 r/min的條件下培養，取對數生長期的菌液離心，收集菌體，再用無菌水洗滌2次，然后將菌體重懸浮于無菌水中，調節菌體濃度，使菌液于600 nm處的光密度約等于1，制成菌懸液，4 ℃保存備用。

將菌懸液按一定接種量（φ，%）接種至以NH3-N為唯一氮源的異養硝化培養基中，ρ（NH3-N）=212.02 mg/L，在搖床轉速150 r/min的條件下培養，分別考察碳源種類、m（C）∶m（N）、培養溫度、初始pH及接種量對菌株硝化性能的影響。

1.2.4 煉油廢水中NH3-N的降解

將篩選得到的異養硝化-好氧反硝化菌按一定接種量接種于100 mL氣浮后的實際煉油廢水中，考察菌株在最佳培養條件下對實際廢水中NH3-N的去除效果。

1.3 分析方法

細菌生長量采用光密度法測定［6］；ρ（NH3-N）采用納氏試劑分光光度法測定［7］。

2 結果與討論

2.1 菌種鑒定

經分離純化，獲得12株同時具有異養硝化和好氧反硝化能力的菌株。選取1株硝化和反硝化綜合性能最好的菌株（命名為WY6）進行研究。在異養硝化固體培養基上，WY6菌落呈乳白色，圓形，中間凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊，無水溶性色素產生，革蘭氏染色呈陰性。該菌不能水解淀粉和明膠，產生H2S；甲基紅反應呈陽性，而二乙酰反應、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原實驗、葡萄糖產酸實驗呈陰性。WY6菌的菌落形態和革蘭氏染色菌體的顯微鏡照片見圖1。

菌株WY6通過16S rDNA測序后，將所得堿基序列在GenBank數據庫中進行比對，并用MEGA 5.0軟件計算序列的系統進化距離，構建菌株WY6的系統發育樹，見圖2。由圖2可見，在進化過程中與菌株WY6親緣關系最近的均為鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）。結合WY6的形態學特征、生理生化特征，將其鑒定為鮑曼不動桿菌。

圖1 WY6菌的菌落形態（a）和革蘭氏染色菌體（b）的顯微鏡照片

圖2 菌株WY6的系統發育樹

2.2 培養條件

2.2.1 碳源

WY6為異養硝化菌，可以利用培養基或廢水中的有機碳源。在m（C）∶m（N）=8、培養溫度為30 ℃、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下，將WY6分別接種至以葡萄糖、蔗糖、乳糖、丁二酸鈉和檸檬酸鈉為碳源的異養硝化培養基中，考察碳源種類對NH3-N去除效果的影響。碳源種類對ρ（NH3-N）的影響見圖3。由圖3可見：分別以丁二酸鈉和檸檬酸鈉為碳源時，ρ（NH3-N）下降速率最快，以蔗糖為碳源時居中，以葡萄糖、乳糖為碳源時最慢；當以丁二酸鈉為碳源、培養時間為26 h時，ρ（NH3-N）由212.02 mg/L 降至8.52 mg/L。這可能是因為WY6菌能直接利用丁二酸鈉和檸檬酸鈉，而以葡萄糖、乳糖為碳源時，還原性糖與氨類物質在高壓蒸汽滅菌時會在高溫條件下發生美拉德反應，部分生成難以利用的大分子物質的緣故［8］。因此，WY6菌適宜的碳源為丁二酸鈉，這與陳趙芳等［9-10］的研究結果類似。

圖3 碳源種類對ρ（NH3-N）的影響

2.2.2 m（C）∶m（N）

Joo等［11］的研究結果表明，m（C）∶m（N） 是影響異養硝化菌NH3-N去除效果的重要因素。在以丁二酸鈉為碳源、培養溫度為30 ℃、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下，m（C）∶m（N）對ρ（NH3-N）的影響見圖4。由圖4可見：m（C）∶m（N）越高，NH3-N去除效果越好，反之則越差；當m（C）∶m（N）大于10時，3條ρ（NH3-N）去除曲線幾乎重合。說明有機碳源是WY6菌生長的限制性因素，碳源越豐富越有利于NH3-N的去除。因此在后續實驗中，m（C）∶m（N）取為10。

圖4 m（C）∶m（N）對ρ（NH3-N）的影響

2.2.3 培養溫度

培養溫度主要影響微生物酶的活性，從而影響其生長和代謝［12］。在以丁二酸鈉為碳源、m（C）∶m（N）=10、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下，培養溫度對ρ（NH3-N）的影響見圖5。

圖5 培養溫度對ρ（NH3-N）的影響

由圖5可見：培養溫度為20～30 ℃時，隨培養溫度的升高，NH3-N去除效果變好；當培養溫度進一步升高至37 ℃時，NH3-N去除效果變差。這可能是由于酶的活性受到一些抑制，使NH3-N的去除速率放緩。由此可見，WY6菌適宜的培養溫度為30 ℃。

2.2.4 接種量

接種量的大小影響細菌在培養基中的生長繁殖速率，采用較大的接種量可以縮短細菌達到對數生長期的時間，但接種量過大容易引起溶氧不足，而且也不經濟；相反，接種量過小則會延長細菌的延滯期。在以丁二酸鈉為碳源、m（C）∶m（N）= 10、培養溫度為30 ℃、初始pH為7.1的條件下，接種量對ρ（NH3-N）的影響見圖6。由圖6可見，接種量在2.0%～10.0%范圍內的NH3-N去除效果相差不大。考慮到方法的經濟性，將WY6菌接種量定為2.0%。

圖6 接種量對ρ（NH3-N）的影響

2.2.5 初始pH的影響

溶液酸堿度是影響硝化作用的重要因素［13］。在以丁二酸鈉為碳源、m（C）∶m（N）=10、培養溫度為30 ℃、接種量為2.0%的條件下，初始pH對ρ（NH3-N）的影響見圖7。

圖7 初始pH對ρ（NH3-N）的影響

由圖7可見：初始pH在4.0～9.0范圍內時，提高初始pH可加快NH3-N的去除，即弱堿性區間內的NH3-N去除速率較中性及弱酸性區間快，這是由于弱酸性不利于細菌的生長，導致NH3-N的去除速率緩慢；在初始pH為9.0、培養時間為20 h時，ρ（NH3-N）由245.46 mg/L 降至9.71 mg/L，平均NH3-N去除速率為11.79 mg/（L·h）。實驗結果表明，WY6菌適宜的初始pH與實際廢水的pH較為接近，方便該菌的實際應用。

2.3 WY6菌對煉油廢水中NH3-N的去除效果

在最佳條件下，WY6菌對煉油廢水中NH3-N的去除效果見圖8。由圖8可見：WY6菌能很快適應實際廢水環境，且接種量為0.5%和2.0%時NH3-N的去除效果相當；當接種量為0.5%時，煉油廢水經32 h處理后，ρ（NH3-N）由初始時的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率達98.4%。該菌表現出良好的硝化能力和潛在的應用前景。

圖8 WY6菌對煉油廢水中NH3-N的去除效果

3 結論

a）通過硝化培養基富集、馴化，從煉油活性污泥中篩選出一株具有異養硝化-好氧反硝化能力的菌株WY6，經鑒定為鮑曼不動桿菌。

b）菌株WY6的適宜培養條件為：以丁二酸鈉為碳源、培養溫度30 ℃、初始pH 9.0、培養基的m（C）∶m（N）=10、接種量2.0%。在此條件下培養20 h，可將NH3-N質量濃度由245.46 mg/L降至9.71 mg/L，NH3-N平均去除速率為11.79 mg/（L·h）。

c）WY6菌對實際煉油廢水具有良好的NH3-N去除能力，可在32 h內將NH3-N質量濃度由初始時的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率達98.4%，表現出良好的應用前景。

［1］ 張翼，林玉娟，范洪富，等．石油石化工業污水分析與處理［M］. 北京：石油工業出版社，2006：124 -125.

［2］ 趙新. 煉油廢水中氨氮的去除與控制［J］. 化工環保，2011，31（5）：444 - 446.

［3］ Tuo Baohua，Yan Jiabao，Fan Baoan，et al. Biodegradation Characteristics and Bioaugmentation Potential of a Novel Quinoline-Degrading Strain of Bacillus sp. Isolated from Petroleum-Contaminated Soil［J］. Bioresour Technol，2012，107：55 - 60.

［4］ 東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊［M］. 北京：科學出版社，2001：180 - 181.

［5］ 林海. 環境工程微生物學［M］. 北京：冶金工業出版社，2008：73 - 74.

［6］ 原國家環境保護總局《水和廢水監測分析方法》編委會. 水和廢水監測分析方法［M］. 北京：中國環境科學出版社，2000：279 - 281.

［7］ 李鈞敏主編. 分子生物學實驗［M］. 杭州：浙江大學出版社，2010：42 - 43.

［8］ 儀宏，王麗麗，馮惠勇，等. 含葡萄糖培養基高溫滅菌變色及其防范措施的研究［J］. 釀酒，2003，30（2）：42 - 43.

［9］ 陳趙芳，尹立紅，浦躍樸，等. 一株異養硝化菌的篩選及其脫氮條件［J］. 東南大學學報：自然科學版，2007，37（3）：486 - 490.

［10］ 曾慶梅，司文攻，李志強，等. 一株高效異養硝化菌的選育鑒定及其硝化條件［J］. 微生物學報，2010，50（6）：803 - 810.

［11］ Joo H，Hirai M，Shoda M. Characteristics of Ammonium Removal by Heterotrophic Nitrif i cation-Aerobic Denitrif i cation by Alcaligenes faecalis No.4［J］. J Biosci Bioeng，2005，100（2）：184 - 191.

［12］ 沈萍，陳向東. 微生物學［M］. 北京：高等教育出版社，2010：148 - 150.

［13］ 高峰，蔣偉群，黃強. SBR工藝脫除苯胺廢水中的總氮［J］. 化工環保，2010，30（9）：1 - 3.

（編輯 葉晶菁）

Screening of Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification Strain from Refinery Wastewater

Wu Wenli，Yan Jiabao，Ji Nannan，Cao Xiaoshi，Hu Xixi，Wu You
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China）

A heterotrophic nitrif i cation-aerobic denitrif i cation bacteria strain WY6 was isolated from activated sludge in the refinery wastewater treatment system. The WY6 was characterized and identified by physiological and biochemical experiments. The effects on nitrif i cation ability of the strain were studied，such as carbon source，m（C）∶m（N） of the medium，culture temperature，initial pH and inoculation amount. And its NH3-N removal ability was also investigated. The identif i cation results show that WY6 is a strain of Acinetobacter baumannii，and the suitable culture conditions for it are as follows：using sodium succinate as carbon source，culture temperature 30 ℃，initial pH 9.0，m（C）∶m（N）=10，inoculation amount 2.0%. When the ref i nery wastewater has treated under these conditions for 20 h，the NH3-N mass concentration can be decreased from 245.46 mg/L to 9.71 mg/L with 11.79 mg/（L·h） of average ammonia removal speed. After treated for 32 h by strain WY6，the NH3-N mass concentration of the actual ref i nery wastewater can be decreased from73.74 mg/L to 1.15 mg/L with 97.8% of NH3-N removing rate，which shows a good application prospect.

refinery wastewater；ammonia nitrogen；heterotrophic nitrification-aerobic denitrification；strain screening

X172

A

1006-1878（2015）04-0354-05

2015 - 03 - 18；

2015 - 04 - 29。

武文麗（1990—），女，甘肅省白銀市人，碩士生，電話 18971048322，電郵 121135637@qq.com。聯系人：顏家保，電話 18062689295，電郵 yanjb9198@126.com。

武漢科技大學研究生創新創業基金重點項目（JCX0006）；武漢科技大學國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201310488009）。