益氣活血法對缺氧損傷血管內皮細胞保護作用的研究*

陳 冰，李玉梅，張立石，薛 欣，馬雅鑾

(中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

【實驗研究】

益氣活血法對缺氧損傷血管內皮細胞保護作用的研究*

陳 冰，李玉梅，張立石，薛 欣，馬雅鑾△

(中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

目的:觀察以黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液聯合用藥為代表的益氣活血法對缺氧損傷的血管內皮細胞的保護作用。方法:建立人臍靜脈內皮細胞缺氧損傷模型，實驗設對照組、模型組、黃芪組、川芎嗪組及聯合用藥組。采用MTT檢測法、AnnexinV-FITC/PI雙染結合流式細胞術凋亡檢測法和ELISA檢測法，觀察藥物對HUVEC增殖、凋亡和功能(分泌NO和ET)的影響。結果:與模型組比較，黃芪組和川芎嗪組及聯合用藥組均可不同程度地減輕缺氧對HUVEC的損傷，提高其生存率，降低其凋亡率，促進NO的分泌，抑制ET的分泌，兩藥聯用比單用效果好。結論:益氣活血法可通過促進增殖、抗凋亡及改善細胞分泌功能，有效減輕缺氧后血管內皮細胞的損傷。

益氣活血法;人臍靜脈內皮細胞;缺氧損傷;凋亡

冠心病屬于中醫“心痛”、“胸痹”范疇，病位在心，病機多為本虛標實，臨床論治多采用益氣活血、行氣化痰、通陽開痹等方法。本研究觀察以黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液聯合用藥為代表的益氣活血法對缺氧損傷的血管內皮細胞的保護作用，并探討其作用機理。

1 材料

1.1 藥品與試劑

低糖DMEM、胎牛血清、肝素鈉、內皮細胞生長因子購自美國Hyclone公司，內皮細胞生長因子購自瑞士ROCHE公司，MTT購自德國Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自美國BD公司，一氧化氮(Nitrogen monoxidum，NO)測定試劑盒、內皮素(Endothelin，ET)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。黃芪注射液購自正大青春寶藥業有限公司(批號1409021)，鹽酸川芎嗪注射液購自哈爾濱三聯藥業有限公司(批號120201A1)。

1.2 儀器

IX-70倒置顯微鏡:日本Olympus公司，FACS Callibur流式細胞儀:美國BD公司，Multiskan酶標儀:美國Thermo公司，3K15高速低溫離心機:德國Sigma公司，-80℃低溫冰箱:美國Thermo公司。

2 方法

2.1 人臍靜脈內皮細胞的培養

取健康胎兒臍帶以PBS反復沖洗臍靜脈，注入0.1%Ⅱ型膠原酶，兩端以止血鉗夾住，37℃消化20 min，收集消化液離心。以內皮細胞培養液(低糖DMEM，20%胎牛血清，10 μg/mL內皮細胞生長因子，10 U/mL肝素鈉)重懸細胞，接種于培養瓶中。待細胞長成融合狀態進行形態學鑒定和免疫組化鑒定(Ⅷ因子相關抗原抗體陽性，純度大于99%)，第3～5代細胞用于實驗。將細胞分成對照組、模型組、不同濃度黃芪組、不同濃度川芎嗪組和聯合用藥組(黃芪注射液+鹽酸川芎嗪注射液)。

2.2 血管內皮細胞缺氧損傷模型的建立［1］

取HUVEC傳代于相應的培養器皿中，培養24 h后長成致密單層，把培養液換成含相應濃度藥物的PBS，放置于缺氧罐(溫度37℃，100%氮氣)中4 h造成細胞缺氧損傷模型，再換成含相應濃度藥物的普通培養液(低糖DMEM，10%胎牛血清)復氧培養24 h或者48 h，分別收集細胞及上清用于指標檢測。

2.3 指標檢測

2.3.1 黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液對正常HUVEC的影響 將細胞以5000/孔的密度接種于96孔板中，待24 h后加入不同濃度的黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液，作用48 h后，MTT法檢測藥物對HUVEC存活率的影響。

2.3.2 藥物對缺氧損傷HUVEC存活率的影響 以5000/孔的細胞密度將HUVEC接種于96孔板中，按照(2.2)方法造模后并給予藥物處理，作用48 h后，MTT法檢測藥物對缺氧損傷HUVEC存活率的影響。

2.3.3 藥物對缺氧損傷HUVEC凋亡的影響

以2×104/孔的細胞密度將HUVEC接種于6孔板中，按照方法(2.2)造模并給予相應藥物處理，作用24 h后，收集細胞采用Annexin V-FITC/PI結合流式細胞儀檢測細胞早期和晚期的凋亡率。

2.3.4 藥物對缺氧損傷HUVEC分泌功能的影響 實驗方法同2.3.3，作用24 h后收集細胞上清，ELISA法檢測藥物對NO、ET的影響。

2.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 11.5進行統計，實驗數據結果以均值±標準差(±s)表示，α=0.05，數據經過正態性檢驗和方差齊性檢驗后，進行單因素方差分析和兩兩比較的統計學分析。

3 結果

3.1 黃芪注射液對正常HUVEC存活率影響

表1顯示，400 μg/mL劑量的黃芪注射液對正常HUVEC增殖的促進作用為10.95%，統計學差異顯著;其余劑量均無明顯的促進增殖作用，因此選用400 μg/mL劑量用于后續實驗。

3.2 鹽酸川芎嗪注射液對正常HUVEC存活率的影響

表2顯示，60 μg/mL及以上劑量的鹽酸川芎嗪注射液對正常HUVEC的增殖有抑制作用，統計學差異顯著;15 μg/mL和30 μg/mL劑量的鹽酸川芎嗪注射液無明顯的抑制增殖作用，因此選用15 μg/ mL的劑量用于后續實驗。

表1 黃芪注射液對正常HUVEC存活率的影響(±s)

注:與0劑量組比較:*P＜0.05

劑量(μg/mL) 例數 存活率(%) 0 100.00 4 6 99.53±4.36 6 40 6 101.24±5.23 400 6 110.95±5.69*1000 6 101.43±5.39 2000 6 99.74±4.77

表2 鹽酸川芎嗪注射液對正常HUVEC存活率的影響(±s)

表2 鹽酸川芎嗪注射液對正常HUVEC存活率的影響(±s)

注:與0劑量組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

劑量(μg/mL) 例數 存活率(%) 100.00 15 6 98.70±2.48 30 6 97.41±2.21 60 6 92.04±1.18*120 6 88.21±5.96*240 6 74.89±5.49 0 6＊＊

3.3 不同藥物對缺氧損傷HUVEC存活影響

表3顯示，與模型組比較，黃芪組、川芎嗪組及聯合用藥組均可顯著提高缺氧損傷HUVEC的存活率(P＜0.01);聯合用藥組作用最強，與黃芪組及川芎嗪組比較差異有統計學意義(P＜0.01);黃芪組作用次之，與川芎嗪組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

表3 藥物對缺氧損傷HUVEC存活的影響(±s)

表3 藥物對缺氧損傷HUVEC存活的影響(±s)

注:與模型組比較:＊＊P＜0.01;與黃芪組比較:△△P＜0.01;與川芎嗪組比較:☆☆P＜0.01

組別 例數 存活率(%) 100.00模 型 組 6 18.77±2.30黃 芪 組 6 35.84±2.25＊＊川 芎 嗪 組 6 23.08±1.83＊＊△△聯 合 用 藥 組 6 48.00±3.94對照組6＊＊△△☆☆

3.4 不同藥物對缺氧損傷HUVEC凋亡影響

表4顯示，HUVEC缺氧損傷后，模型組早期和晚期凋亡率分別為21.74%和11.78%，與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。與模型組比較，黃芪組可降低HUVEC凋亡率(P＜0.05)，聯合用藥組可顯著降低HUVEC凋亡率(P＜0.01)。聯合用藥組作用強于黃芪組，與黃芪組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。川芎嗪組對凋亡率無明顯作用。

表4 藥物對缺氧損傷HUVEC凋亡的影響(±s)

表4 藥物對缺氧損傷HUVEC凋亡的影響(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05;＊＊P＜0.01;與黃芪組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與川芎嗪組比較:☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

組 別例數早期凋亡率(%)晚期凋亡率(%)總凋亡率(%) 6 2.96±0.67 2.14±0.33 5.10±0.86模 型 組 6 21.74±3.93 11.78±2.90 33.51±3.14黃 芪 組 6 17.24±2.31* 8.63±1.41* 25.87±3.23*川 芎 嗪 組 6 20.32±2.72 10.03±1.84 30.35±3.67△聯合用藥組 6 12.18±1.24＊＊△△☆☆ 6.42±1.14＊＊△☆☆ 18.60±1.85對照組＊＊△△☆☆

3.5 不同藥物對缺氧損傷HUVEC分泌功能的影響

表5顯示，各組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。川芎嗪組及聯合用藥組均可顯著促進HUVEC分泌NO，抑制HUVEC分泌ET，與模型組比較差異有統計學意義。黃芪注射液組僅對NO的分泌有改善(P＜0.05)，川芎嗪組促進NO的分泌作用強于黃芪注射液組(P＜0.05);聯合用藥組對HUVEC分泌NO和ET功能的改善作用最強，與黃芪組、川芎嗪組比較差異有統計學意義。

表5 不同藥物對缺氧損傷HUVEC分泌NO和ET影響(±s)

表5 不同藥物對缺氧損傷HUVEC分泌NO和ET影響(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05;＊＊P＜0.01;與黃芪組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與川芎嗪組比較:☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

組 別 例數 NO(μmol·mL-1) ET(pg·mL-1) 6 95.02±7.46 38.14±4.40模 型 組 6 27.40±5.77 67.38±6.50黃 芪 組 6 36.87±6.82* 62.49±3.53川芎 嗪 組 6 45.67±5.96＊＊△ 54.60±2.51＊＊△△聯合用藥組 6 55.81±7.47＊＊△△☆ 48.70±3.51對照組＊＊△△☆☆

4 討論

血管內皮細胞為襯貼于血管腔面的單層扁平上皮細胞，它沿著血管內壁單層有序排列，直接與血液的各種成分相接觸，是血液、血流和血管三者相互聯系的界面和環節。研究表明，內皮具有多種生理功能，參與機體的血管調節、凝血、纖溶、免疫、物質轉運和生物活性物質釋放等生命活動。血管內皮細胞損傷尤其內皮細胞凋亡是冠狀動脈粥樣硬化發生的早期事件，在冠心病的形成和發展中起重要作用［2］。內皮細胞能合成和分泌多種血管活性物質，如NO、ET等。NO對血管有擴張作用，ET對血管有收縮作用，正常情況下二者保持動態平衡，NO的作用略占優勢，以保持血管壁的平滑和血流的通暢。內皮細胞受到損傷時，NO和ET之間的動態平衡受到破壞，NO生成量下降，ET表達量增加，導致微血管痙攣并阻塞血流。研究表明，保護內皮細胞、改善其生存狀態以及恢復其生理功能，對于防治冠心病有著重要的作用和意義［3-4］。

中醫認為冠心病其病位主要在胸和心脈。胸在上焦，位屬于陽，為清陽所聚之處，內藏心肺，為氣血活動的源泉;心主血脈，血賴心脈的活動而運行全身以起濡養作用。若陽氣不足則血脈運行失暢，心脈瘀阻;心脈瘀阻則陰血不足，心失所養，變生冠心病諸證。益氣活血法的立法源于《素問·陰陽應象大論》有“定其血氣，各守其鄉，血實者宜決之，氣虛者宜掣引之”的論述。“方從法出，法隨證立”，氣虛血瘀證是冠心病最常見的證候，所以益氣活血法是冠心病的重要治法。補陽還五湯出自清代醫家王清任的《醫林改錯》，所治之證系由中風后氣虛不能推動血行、氣虛血瘀，導致半身不遂、口眼歪斜等癥狀。補陽還五湯是益氣活血法的經典方劑。方中重用生黃芪以大補肺脾胃之氣使氣血旺盛;配合少量的當歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花多種活血祛瘀藥逐瘀通絡，之所以用大劑量黃芪為主藥的目的，就是以補氣行血通絡。

本研究在探討益氣活血法對內皮細胞保護作用的實驗中，取法于補陽還五湯之方義，選用大劑量的黃芪注射液和小劑量的鹽酸川芎嗪注射液聯合用藥。實驗中發現，二者聯用后可抑制缺氧損傷內皮細胞的凋亡，差異有統計學意義;可促進內皮細胞分泌NO，并抑制其分泌ET，從而發揮舒張血管的作用;聯合用藥的效果強于單用黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液。

此外，本研究在實驗中也發現，單用黃芪注射液有明確的保護內皮細胞的作用，但對改善內皮細胞分泌功能的效果略差，與文獻報道一致［5-6］。單用鹽酸川芎嗪注射液，大劑量的鹽酸川芎嗪注射液對正常的內皮細胞有毒性，小劑量的鹽酸川芎嗪注射液也有保護內皮細胞的作用，功效不如黃芪注射液，但對改善內皮細胞分泌功能效果優于黃芪注射液。

臨床病證往往錯綜復雜，單藥應用往往難以收到滿意的效果，聯合用藥是臨床的必然趨勢。黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液均為臨床常用的中藥注射液制劑，其有效性和安全性已經過多年的實驗室和臨床驗證，臨床也時常兩藥聯用［7-8］，但一直缺少聯用的實驗室研究。希望本研究的結果能為益氣活血法的治法以及黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液的聯合用藥提供些許實驗室依據。

［1］陳冰，李毅，商悅.葛根素對缺氧損傷的大鼠腦微血管內皮細胞凋亡和功能的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2009，15 (4):72-79.

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Protective Effect of Supplementing Qi and Activating Blood Circulation Method on Vascular Endothelial Cells in Hypoxia Injury

CHEN Bing，LI Yu-mei，ZHANG Li-shi，XUE Xin，MA Ya-luan△
(Institute of Basic Theory of TCM，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:To observe effects of the combination of astragalus injection and ligustrazine injection，which is used as the representative of Yiqi Huoxue method，on the protection of Human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs)in anoxia injury.Methods:HUVEC were intervened with astragalus injection，ligustrazine injection or the combination，then these cells were treated with 100%nitrogen for 4 hours as the anoxia injury.Proliferation of HUVECs were detected by MTT.Apoptosis of HUVECs were analysed by AnnexinV-FITC/PI staining with flow cytometry.And the function of HUVEC by secretion of NO and ET were detected by ELISA.Results:Compared with model group，astragalus group，ligustrazine group and the combination group all can reduce the anoxia damage on HUVECs in different extent，by increasing the survival rate，decreasing the apoptosis rate and improving NO levels and lowering ET levels.Combination group works best in all groups.Conclusion:Yiqi huoxue method can effectively reduce the anoxia injury on HUVECs by improving their proliferation，inhibiting their apoptosis and improving their functions by regulating the secretion of NO and ET.

Yiqi Huoxue method;Human umbilical vein endothelial cells;Anoxia injury;Apoptosis

R543

:B

:1006-3250(2015)07-0794-03

2015-02-17

中國中醫科學院自主選題研究項目(YZ-1408);中國中醫科學院自主選題研究項目(YZ-1407)

陳 冰(1975-)，女，遼寧盤錦人，助理研究員，藥學博士，從事證候物質基礎及方證相應研究。

△通訊作者:馬雅鑾(1968-)，女，福建寧德人，研究員，醫學博士，從事中藥抗炎機制相關研究，Tel:010-64014411-2505，E-mail:yaluanma@163.com。