鹿茸中藥復(fù)方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響*

王 劍，鄭洪新，張錦萍，劉 研，劉劍輝，宋光熠，劉瑞輝

(1.遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，沈陽(yáng) 110101;2.遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，沈陽(yáng) 110101; 3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110847)

鹿茸中藥復(fù)方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響*

王 劍1，2，鄭洪新3△，張錦萍1，劉 研1，劉劍輝1，宋光熠1，劉瑞輝1

(1.遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，沈陽(yáng) 110101;2.遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，沈陽(yáng) 110101; 3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110847)

目的:觀察去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠腎組織 Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)，探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)的發(fā)病機(jī)制以及鹿茸中藥復(fù)方的療效機(jī)理。方法:去卵巢復(fù)制骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組、模型組、假手術(shù)組、鹿茸中藥復(fù)方組、鈣爾奇D組、骨疏康組，灌胃給藥12周。應(yīng)用雙能X線骨密度儀檢測(cè)骨密度，實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western Blot檢測(cè)Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果:與正常組比較，模型組股骨骨密度明顯降低、腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低;與模型組比較，鹿茸中藥復(fù)方組、骨疏康組股骨骨密度明顯升高;鹿茸中藥復(fù)方組、鈣爾奇D組、骨疏康組腎組織Msx2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào);鹿茸中藥復(fù)方組腎組織Msx2蛋白表達(dá)明顯上調(diào);與鈣爾奇D組、骨疏康組比較，鹿茸中藥復(fù)方組腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高。結(jié)論:PMOP的發(fā)病機(jī)制之一可能是腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)降低，鹿茸中藥復(fù)方可能通過(guò)上調(diào)腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)，有效防治PMOP，其作用優(yōu)于鈣爾奇D和骨疏康。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥;鹿茸中藥復(fù)方;Msx2

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥 (Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥之一，嚴(yán)重危害老年人的健康，隨著社會(huì)老齡化的增速，PMOP患病人群日益龐大。調(diào)查表明，目前約占我國(guó)人口7%的骨質(zhì)疏松癥患者中半數(shù)為50歲以上的婦女［1］，故深入探討PMOP的發(fā)病機(jī)制和防治方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究依據(jù)中醫(yī)“腎主骨”理論研制具有補(bǔ)腎填精、益髓壯骨功效的鹿茸中藥復(fù)方，通過(guò)觀察腎組織Msx2(muscle segment homeobox gene 2)mRNA及蛋白表達(dá)變化，探討鹿茸中藥復(fù)方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的療效與機(jī)理，為中醫(yī)藥防治PMOP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar雌性大鼠100只，4～5月齡，體質(zhì)量(275±25)g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司(合格證號(hào)0004179)。

1.2 藥品

鹿茸中藥復(fù)方由鹿茸、淫羊藿、牡蠣組成，對(duì)照藥鈣爾奇D(Wyeth)、骨疏康顆粒(遼寧康辰藥業(yè)有限公司)。

1.3 主要儀器

XR-36型雙能X線骨密度儀(NORLAND)、ABI 7500型定量 PCR儀、PowerPac200電泳儀(BIORAD)等。

TRIZOL(康為世紀(jì))、實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑盒(TaKaRa)、羊抗Msx2多克隆抗體(santa cruz)、堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(北京中山生物公司)等。

2 方法

2.1 分組

預(yù)實(shí)驗(yàn)用7只，余者按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，正常組(A)12只，模型組(B)12只，假手術(shù)組(C)12只，鹿茸中藥復(fù)方組(D)20只，鈣爾奇D組(E)18只，骨疏康組(F)19只。

2.2 造模

正常組除外其余麻醉，2%戊巴比妥鈉腹腔注射(35 mg/kg)，然后腹部切口行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，其中假手術(shù)組只切切口不摘除卵巢。

2.3 給藥

術(shù)后7 d開(kāi)始每日灌胃1次，連續(xù)12周。大鼠給藥劑量按成人劑量的6.3倍計(jì)算，給藥容積0.5 ml/100 g。A、B、C 3組均給予生理鹽水，D組給予鹿茸中藥復(fù)方1.139 g·kg-1·d-1，E組給予鈣爾奇D 0.126 g鈣·kg-1·d-1，F(xiàn)組給予骨疏康顆粒2.1 g ·kg-1·d-1。

答：勇敢些！不要讓自己被國(guó)際趨勢(shì)和要求控制．明確自己的研究問(wèn)題，并深入思考進(jìn)行研究．當(dāng)然，對(duì)于年輕研究者而言，了解和借鑒一些國(guó)際已有的數(shù)學(xué)教育研究是必要的．但是回顧我們領(lǐng)域內(nèi)目前發(fā)表的研究中高質(zhì)量的、影響深遠(yuǎn)的文章，無(wú)一不是得益于研究者“勇敢”的探究．

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 骨密度(BMD) 取右后肢全股骨剔除附著筋肉，生理鹽水潤(rùn)濕醫(yī)用紗布后包裹骨外，紗布外裹錫紙，-20℃冰箱凍存待測(cè)。應(yīng)用XR-36型雙能X線骨密度儀對(duì)大鼠離體股骨骨密度進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用儀器附帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.4.2 Msx2 mRNA表達(dá) 取左腎皮髓交界處一塊約100 mg的腎組織，放入預(yù)裝1ml Trizol的EP管內(nèi)，-70℃冰箱凍存待測(cè)。按Trizol試劑盒說(shuō)明書抽提樣品總RNA。測(cè)抽提物260 nm與280 nm的吸光度，OD 260/OD 280約2.0，提示為RNA純品。應(yīng)用ABI 7500型定量PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，引物由北京華大基因公司合成。Msx2上游引物:5'-GGG CAC AGA GGA GAT TG-3'，下游引物:5'-GGG AAG AGG TGG ACA GG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度294 bp。由儀器自帶軟件收集擴(kuò)增數(shù)據(jù)并計(jì)算Ct值，以GAPDH(上游引物:5'-CGT ATC GGA CGC CTG GTT-3'，下游引物:5'-CGT GGG TAG AGT CAT ACT GGA AC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度124 bp)為內(nèi)參校準(zhǔn)，采用2-△△Ct(Livak)方法對(duì)Msx2的mRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

2.4.3 Msx2蛋白表達(dá) 取左腎皮髓交界處一塊約100 mg的腎組織放入空白EP管內(nèi)，-70℃冰箱凍存，待做Western Blot。細(xì)胞裂解法提取樣品總蛋白，Lowry法定量，SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)印，羊抗Msx2多克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗羊IgG孵育，酶顯法顯色。Tanon-2500R型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)成像，使用Scion Image軟件分析灰度值。以GAPDH為內(nèi)參校準(zhǔn)，以Msx2條帶灰度值/ GAPDH條帶灰度值來(lái)表示其相對(duì)蛋白表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

大鼠在灌胃期間死亡5只，取材時(shí)共88只。

3.1 骨密度

表1顯示，與正常組比較，模型組明顯降低(P＜0.001);與模型組比較，鹿茸中藥復(fù)方組、骨疏康組明顯升高(P＜0.05)，鈣爾奇D組雖有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠離體股骨骨密度比較(±s)

表1 各組大鼠離體股骨骨密度比較(±s)

注:與正常組比較:＊＊＊P＜0.001;與模型組比較:△P＜0.05

組別 例數(shù) 股骨骨密度(g/cm2) 12 0.1375±0.0063模 型 組 12 0.1259±0.0060＊＊＊假 手 術(shù) 組 11 0.1331±0.0109△鹿 茸 中 藥 復(fù) 方 組 19 0.1327±0.0095△鈣 爾 奇 D 組 17 0.1286±0.0058骨 疏 康 組 17 0.1321±0.0057正常組△

3.2 Msx2 mRNA表達(dá)

表2顯示，與正常組比較，模型組明顯降低(P＜0.001);與模型組比較，鹿茸中藥復(fù)方組(P＜0.001)、鈣爾奇 D組(P＜0.01)、骨疏康組(P＜0.01)明顯上調(diào);與鈣爾奇D組、骨疏康組比較，鹿茸中藥復(fù)方組明顯升高(P＜0.01)。

3.3 Msx2蛋白表達(dá)

圖1表3顯示，與正常組比較，模型組明顯降低(P＜0.001);與模型組比較，鹿茸中藥復(fù)方組明顯上調(diào)(P＜0.01)，鈣爾奇D組、骨疏康組雖有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與鈣爾奇D組、骨疏康組比較，鹿茸中藥復(fù)方組明顯升高(P＜0.05)。

表2 各組大鼠腎組織Msx2 mRNA表達(dá)(±s)

表2 各組大鼠腎組織Msx2 mRNA表達(dá)(±s)

注:與正常組比較:＊＊＊P＜0.001;與模型組比較:△△P＜0.01，△△△P＜0.001;與鈣爾奇D組比較:★★P＜0.01;與骨疏康組比較:※※P＜0.01

組別 例數(shù) Msx2(mRNA) 10 1.001±0.067模 型 組 10 0.326±0.043＊＊＊假 手 術(shù) 組 10 0.927±0.077△△△鹿 茸 中 藥 復(fù) 方 組 10 0.776±0.035△△△★★※※鈣 爾 奇 D 組 10 0.587±0.075△△骨 疏 康 組 10 0.538±0.120正常組△△

圖1 腎組織Msx2、GAPDH蛋白Western Blot條帶

4 討論

PMOP指主要由絕經(jīng)后雌激素水平降低引起的骨質(zhì)疏松癥。我國(guó)PMOP患病人數(shù)據(jù)調(diào)查不少于2000萬(wàn)，患病人群日益龐大，深入探討其發(fā)病機(jī)制和防治方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

表3 各組大鼠腎組織Msx2蛋白表達(dá)(±s)

表3 各組大鼠腎組織Msx2蛋白表達(dá)(±s)

注:與正常組比較:＊＊＊P＜0.001;與模型組比較:△△P＜0.01，△△△P＜0.001;與鈣爾奇D組比較:★P＜0.05;與骨疏康組比較:※P＜0.05

組別 例數(shù) Msx2(蛋白) 10 0.780±0.115模型正常組10 0.435±0.048組 10 0.416±0.059＊＊＊假 手 術(shù) 組 10 0.814±0.134△△△鹿 茸 中 藥 復(fù) 方 組 10 0.584±0.070△△★※鈣 爾 奇 D 組 10 0.468±0.064骨 疏 康 組

中醫(yī)學(xué)古籍中雖沒(méi)有“骨質(zhì)疏松癥”這一病名的記載，但有關(guān)“骨痹”(骨重不可舉、骨髓酸痛)、“骨痿”(腰脊不舉)、“骨縮病”(諸骨皆枯，漸至短縮)等描述均與骨質(zhì)疏松癥的癥狀(骨痛、腰背痛最多見(jiàn)，駝背、變矮、骨折)比較相似，因此探討骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)病因病機(jī)可參照中醫(yī)古籍對(duì)相關(guān)骨病的認(rèn)識(shí)。《素問(wèn)·痿論》:“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿。”《扁鵲心書·骨縮》:“此由腎氣虛憊，腎主骨，腎水既涸，則諸骨皆枯，漸至短縮。”中醫(yī)理論認(rèn)為“腎藏精生髓主骨”，骨病多責(zé)之于腎。《素問(wèn)·六節(jié)藏象論》:“腎者、主蟄，封藏之本，精之處也……其充在骨。”《素問(wèn)·痿論》:“腎主身之骨髓。”《素問(wèn)·脈要精微論》:“骨者髓之府”，都說(shuō)明腎主藏精，精生髓，髓居于骨中，骨賴髓以充養(yǎng)。《靈樞·本神》:“精傷則骨酸痿厥”，說(shuō)明腎精虧虛，生髓不足，無(wú)以養(yǎng)骨而發(fā)生骨質(zhì)疏松等病變。《素問(wèn)·上古天真論》:“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長(zhǎng)……四七筋骨堅(jiān)……七七……天癸竭，地道不通，故形壞而無(wú)子也”，說(shuō)明女子盛年之前，腎中精氣與齡俱充，生髓充盛，滋養(yǎng)骨骼，骨堅(jiān)有力;盛年之后，腎中精氣與齡俱衰，七七絕經(jīng)后，精虧生髓不足，骨骼失于滋養(yǎng)而痿軟無(wú)力即發(fā)骨質(zhì)疏松。因此，PMOP的病機(jī)是腎虛精虧、髓減骨枯，防治該病可選用補(bǔ)腎填精、益髓壯骨法。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，腎小管對(duì)Ca2+的重吸收可以調(diào)節(jié)血鈣水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素分泌，影響破骨細(xì)胞分化及其骨吸收活性，間接調(diào)節(jié)骨吸收［2，11］。瞬時(shí)性受體電位通道5(transient receptor potential vanilloid 5，TRPV5)是介導(dǎo)腎小管主動(dòng)重吸收Ca2+的主要蛋白，其表達(dá)下降或失活可能導(dǎo)致尿鈣顯著增多［3］。Msx基因家族的Msx2可通過(guò)對(duì)其下游一系列基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)調(diào)控作用激活TRPV5。Msx2抑制 Runx2轉(zhuǎn)錄［4］，Runx2上調(diào) Osterix轉(zhuǎn)錄［5-6］，Osterix阻止PPARγ基因表達(dá)［7］，PPARγ上調(diào)血清糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1的mRNA表達(dá)［8-9］;血清糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶 1激活TRPV5［8-10］，從而使腎小管對(duì)Ca2+的重吸收增加，血鈣濃度升高，從而使甲狀旁腺主細(xì)胞的活動(dòng)降低，甲狀旁腺激素的分泌下降，受其誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化減少，受其促進(jìn)的破骨細(xì)胞骨吸收活性減弱，從而減少骨吸收［11］。

Msx2在PMOP的發(fā)病機(jī)制及其中醫(yī)藥治療方面的研究，筆者尚未查閱到相關(guān)文獻(xiàn)。雌性大鼠行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)造模是研究PMOP的經(jīng)典模型［12］。本研究即采用此法建立PMOP動(dòng)物模型，以腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)作為效應(yīng)指標(biāo)，研制具有補(bǔ)腎填精、益髓壯骨功效的鹿茸中藥復(fù)方。君藥鹿茸性溫、味甘、咸，歸腎、肝經(jīng)，有壯腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨等功效。現(xiàn)代研究表明，鹿茸含有多種生長(zhǎng)因子，可刺激成骨細(xì)胞分化、增殖，促進(jìn)骨的生長(zhǎng)、修復(fù)，防治骨質(zhì)疏松;臣藥淫羊藿性溫、味辛、甘，歸腎、肝經(jīng)，有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨等功效。現(xiàn)代研究表明，淫羊藿的有效藥理成分淫羊藿苷能促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)其成骨分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化，促進(jìn)骨形成，抑制破骨細(xì)胞分化和功能，抑制骨吸收，防治骨質(zhì)疏松;佐藥牡蠣性微寒、味咸，歸腎、肝經(jīng)，具有補(bǔ)腎壯骨、滋陰潛陽(yáng)的功效。現(xiàn)代研究表明，牡蠣中含90%以上的碳酸鈣，補(bǔ)鈣效果好，可防治骨質(zhì)疏松。作為實(shí)驗(yàn)因素，選用西醫(yī)臨床治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥鈣爾奇D(藥理作用是促進(jìn)腸道吸收鈣、磷和骨骼正常鈣化)和中藥復(fù)方治療骨質(zhì)疏松癥的骨疏康顆粒(具有補(bǔ)腎益氣、活血壯骨的功效)為對(duì)照藥，探討PMOP的發(fā)病機(jī)制以及鹿茸中藥復(fù)方的療效機(jī)理。結(jié)果顯示，模型組骨密度比正常組明顯降低，說(shuō)明本研究成功復(fù)制了PMOP動(dòng)物模型。模型組腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)比正常組明顯降低，可能通過(guò)影響其下游一系列基因表達(dá)而增強(qiáng)骨吸收。與模型組比較，鹿茸中藥復(fù)方明顯上調(diào)腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)，可能通過(guò)級(jí)聯(lián)調(diào)控其下游一系列基因的表達(dá)而減少骨吸收，從而使骨密度明顯升高，療效顯著，勝于骨疏康顆粒;鈣爾奇 D雖亦可明顯上調(diào)腎組織 Msx2的mRNA表達(dá)，但對(duì)其蛋白表達(dá)和骨密度的升高均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制之一可能是腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)降低;具有補(bǔ)腎填精、益髓壯骨功效的鹿茸中藥復(fù)方可明顯上調(diào)腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達(dá)，有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，療效勝于鈣爾奇D及骨疏康顆粒，臨床可選用補(bǔ)腎填精、益髓壯骨法防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。

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Effects of Antler Prescription on the Expression of Msx2 mRNA and Protein in Renal Tissue of Ovariectomy Osteoporosis rats

WANG Jian1，2，ZHENG Hong-xin3△，ZHANG Jin-ping1，LIU Yan1，LIU Jian-hui1，SONG Guang-yi1，LIU Rui-hui1
(1.Liaoning Vocational College of Medicine，Shenyang 110101，China;2.Liaoning Institute of Basic Medicine，Shenyang 110101，China;3.Basic Medical College，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，China)

Objective:To discuss the pathogenesis of postmenopausal osteoporosis(PMOP)and the therapeutic effect and mechanism of pilose antler traditional Chinese medicine compound by Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues of ovariectomized osteoporosis rats.Methods:We established the osteoporosis rat models by ovariotomy.We divided all the rats into normal group，model group，sham-operated group，pilose antler traditional Chinese medicine compound group，GAIERQI D group and GUSHUKANG group.After 12 weeks of administrating by gavage，we used dual energy X-ray absorptiometry to detect bone mineral density，Real-Time Quantitative RT-PCR to detect Msx2 mRNA expression and Western Blot to detect Msx2 protein expression.Results:Compared with normal group，femur bone mineral density of model group decreased significantly，Msx2 mRNA and protein expression decreased significantly in kidney tissues.Compared with model group，femur bone mineral density of pilose antler traditional Chinese medicine compound group and GUSHUKANG group increased significantly;Msx2 mRNA expression in kidney tissues of pilose antler traditional Chinese medicine compound group，GAIERQI D group and GUSHUKANG group up-regulated significantly;Msx2 protein expression in kidney tissues of pilose antler traditional Chinese medicine compound group up-regulated significantly.Compared with GAIERQI D group and GUSHUKANG group，Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues of pilose antler traditional Chinese medicine compound group both increased significantly.Conclusions:Maybe it is one aspect of the pathogenesis of PMOP that Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues decreases;Pilose antler traditional Chinese medicine compound has better effects of up-regulating Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues to prevent and treat PMOP than GAIERQI D and GUSHUKANG.

postmenopausal osteoporosis(PMOP);pilose antler traditional Chinese medicine compound;muscle segment homeobox gene 2(Msx2)

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0800-03

2015-04-16

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目 (L2011247)-補(bǔ)腎益髓法對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥Runx2相關(guān)基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)調(diào)控作用

王 劍(1978-)，女，遼寧沈陽(yáng)人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥與分子生物學(xué)相關(guān)研究。

△通訊作者:鄭洪新，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)病因病機(jī)理論研究，E-mail:zhenghx2002@126.com。