固定配方加引經藥牛膝對防治兔股骨頭壞死的作用機制研究

商 震，程建姝

(山東省濟南市第三人民醫院，濟南 250101)

固定配方加引經藥牛膝對防治兔股骨頭壞死的作用機制研究

商 震，程建姝

(山東省濟南市第三人民醫院，濟南 250101)

目的:探討中藥固定配方補氣生骨方加引經藥牛膝對兔股骨頭壞死的修復作用并對其機制進行初步研究。方法:通過大腸桿菌內毒素聯合氫化潑尼松龍制作激素性兔股骨頭壞死模型，用補氣生骨方并分別加引經藥牛膝和獨活治療股骨頭壞死，觀察血管分布、組織病理學變化，檢測血清中IGF-1含量及血管VEGF的表達。結果:2周、4周、8周時牛膝組血管面積與模型組比較增加，且差異有統計學意義，均大于固定配方組與獨活組。病理學觀察該方加引經藥牛膝可使骨小梁間隙降低，厚度和體積增加，空骨陷窩率下降，與模型組比較差異有統計學意義，均小于固定配方組和獨活組，并可明顯提高血清中IGF-1含量以及VEGF的表達水平。結論:補氣生骨方加引經藥牛膝可通過提高血清中IGF-1含量以及VEGF的表達水平來促進股骨頭壞死的修復，其中引經藥對于藥物作用的發揮起到了重要引導作用。

引經藥;牛膝;股骨頭壞死

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是由多種因素引發的血液運輸障礙(缺血性壞死)而導致骨內部組織壞死的一種病癥，是一種常見、多發、難治的骨科臨床病［1-2］。目前該病可采用中西醫治療方法，西醫以手術治療為主，但其臨床治療效果并不滿意［3］。中藥在該病的早中期治療中起到一定的延緩作用，并具有一定的優勢。中藥治療主要基于活血化瘀論、壯骨補腎論［4］。常用的中藥配方有補腎活血湯、生骨再造湯、活骨生骨方、補氣生骨方等［5-7］，許多學者主張兩者并重。現代醫學對該病進行了細胞因子調控、分子機制等方面的研究，并取得一定成果。而在我國傳統中醫藥方面多側重于基礎理論、中醫辨證治療，其深度和廣度還有待進一步提高。

本研究通過低劑量脂多糖(LPS)聯合氫化潑尼松龍制作激素性兔股骨頭壞死模型，采用固定配方補氣生骨方并加引經藥牛膝治療兔股骨頭壞死，觀察血管分布、組織病理學變化，通過檢測血清中胰島素生長因子-1(insulin growth factor，IGF-1)含量及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，對其作用機制進行分子水平的研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級健康成年雄性新西蘭大白兔60只，體質量(2.5±0.3)kg，由山東魯抗醫藥股份有限公司實驗動物中心提供，單籠飼養。

1.2 試劑與儀器

大腸桿菌內毒素(美國，sigma);醋酸氫化潑尼松龍(山東，辰欣藥業);青霉素鈉(北京，Solarbio); SABC免疫組化試劑盒、IGF-1酶聯免疫試劑盒(南京，建成);VEGF單克隆抗體(美國，Millipore)。生物組織包埋機(KD-BM，浙江科迪儀器)、切片機(RM 2016，上海徠卡)、醫學圖像分析系統(CT2-BI-2000，中國北航)。

1.3 方法

1.3.1 動物造模與分組 48只新西蘭大白兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內毒素(5 ug/kg)，24 h后重復給藥，同時肌注醋酸氫化潑尼松龍(30 mg/kg)連續4 d，每天注射20萬單位的青霉素鈉以防感染。通過CT掃描篩選出造模成功的動物，并按隨機數字表法分為模型組、固定配方組、牛膝組、獨活組4組，同時另12只作為正常對照組。固定配方組每天灌胃補氣生骨方水煎劑，牛膝組灌胃補氣生骨方水煎劑加牛膝(0.75 g·kg-1·d-1)，獨活組灌胃補氣生骨方水煎藥加獨活(0.75 g·kg-1·d-1)，模型組和正常組給予相同劑量的生理鹽水。

1.3.2 墨汁灌注血管觀察 分別于給藥2周、4周、8周時用3%戊巴比妥鈉麻醉動物(30 mg/ kg)，于腹部切口，剝離暴露腹主動脈和下腔靜脈，插上導管立即注入肝素，然后加壓注入生理鹽水，直至下腔靜脈流出的液體澄清，最后注入墨汁直至兔雙下肢發黑。取雙側股骨頭剔除冗余組織，甲醛固定，鹽酸甲酸脫鈣，梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋、透明、切片，于光鏡下觀察血管分布及形態變化，通過醫學圖像分析系統計算血管面積。

1.3.3 組織病理學觀察 分別于給藥2周、4周、8周時處死動物取雙側股骨頭，剔除冗余組織，甲醛固定，鹽酸甲酸脫鈣，梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋、透明、切片，HE染色觀察其病理學變化。高倍鏡下選取100個骨陷窩計算空骨陷窩率。

1.3.4 血清中IGF-1的測定 于2周、4周、8周時空腹狀態下兔耳后中央動脈取血，離心取上清，-20℃保存。按IGF-1酶聯免疫試劑盒所述方法測定各組不同時間點血清中IGF-1的含量，根據標準品與吸光值作標準曲線，求得IGF-1濃度。

1.3.5 免疫組化VEGF染色 按試劑盒說明將各組2周、4周、8周時的石蠟切片進行脫蠟，過氧化氫洗滌，抗原熱修復，PBS清洗，山羊血清封閉液封閉，依次加入一抗、二抗、SABC，最后DAB顯色劑顯色。通過醫學圖像分析系統對VEGF的表達進行分析，選取多個視野求得平均值，對表達陽性細胞計數。

1.3.6 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05，P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 墨汁灌注血管觀察結果

表1顯示，光鏡下觀察墨汁灌注切片可見，正常組血管被均勻染成黑色并呈網狀。模型組血管稀疏、紊亂，部分出現血栓現象，其面積小于正常組，與正常組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。給藥后3組給藥組血管面積均有所增加;4周、8周時牛膝組血管面積與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01);獨活組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，且4周、8周時牛膝組血管面積均大于固定配方組與獨活組。

表1 各組髓腔中血管面積的比較(±s，μm2)

表1 各組髓腔中血管面積的比較(±s，μm2)

注:與正常組比較:aaP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05，bbP＜0.01

組 別 例數 2周 4周 8周4 255.1±12.3 268.4±34.5 277.8±21.6模 型 組 4 164.2±13.9aa145.9±21.8aa 144.6±18.9aa固定配方組 4 184.6±9.08 199.5±33.0b 203.2±30.1bb牛 膝 組 4 213.4±21.3b 235.8±14.7bb 253.6±24.5bb獨 活 組 4 221.6±18.7b 230.7±22.2b 241.9±19.6正常組b

2.2 組織病理學觀察結果

圖1表2顯示，造模成功的股骨頭組織切片可見，骨小梁稀疏，出現萎縮和連續性中斷現象;骨髓壞死，造血組織明顯減少，髓腔脂肪變性、纖維化;空骨陷窩率增加;破骨細胞增多，骨細胞核皺縮。與模型組比較，給予補氣生骨方治療后骨小梁間隙降低，厚度和體積有所增加，空骨陷窩率下降，在2周、4周、8周時與模型組比較差異有統計學意義;牛膝組與獨活組空骨陷窩率與模型組比較差異有統計學意義，且牛膝組均大于固定配方組和獨活組。

表2 各組兔血清中IGF-1含量比較(±s，ng/ml)

表2 各組兔血清中IGF-1含量比較(±s，ng/ml)

注:與正常組比較:aaP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05，bbP＜0.01

組 別例數 2周 4周 8周4 22.12±0.51 19.62±3.45 20.57±2.16模 型 組 4 12.29±2.12aa 14.52±0.83aa 13.46±1.46a固定配方組 4 14.87±3.03 15.98±0.84 18.45±2.18bb牛 膝 組 4 15.74±2.19b 16.25±2.34b 19.43±1.47bb獨 活 組 4 16.02±2.17b 16.66±1.62b 18.51±0.54正 常 組b

2.3 血清中IGF-1的變化

與正常組比較，3個時間點模型組血清中IGF-1含量均下降，2組間比較差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較，3個實驗組IGF-1含量均上升，在8周時，固定配方組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01);在2周、4周時，牛膝組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，在8周時差異有統計學意義(P＜0.01);在2周、4周、8周時獨活組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。上述結果顯示，給藥組可以提高血清中IGF-1含量，其中牛膝組作用最明顯，獨活組為其次。

圖1 實驗4周時各組股骨頭組織病理切片觀察(100×)

圖2 各組股骨頭空骨陷窩率比較

2.4 VEGF免疫組化結果

光鏡下可見，各組免疫組化切片成骨細胞、軟骨細胞、骨細胞、造血細胞中均有VEGF的表達。與正常組比較，各個時間點模型組VEGF陽性細胞表達數目均減少，差異有統計學意義(P＜0.01)。與模型組比較，3組給藥組陽性細胞表達數目均增加，在2周時與模型組比較，牛膝組差異有統計學意義(P＜0.05)，在4周、8周時比較差異有統計學意義(P＜0.01);固定配方組、獨活組在4周、8周時與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，總體比較結果為正常組＞牛膝組＞獨活組＞固定配方組＞模型組。

表3 各組免疫組化VEGF表達陽性細胞數目比較(±s)

表3 各組免疫組化VEGF表達陽性細胞數目比較(±s)

注:與正常組比較:aaP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05，bbP＜0.01

組 別 例數 2周 4周 8周4 201±12.0 189±22 221±16模 型 組 4 122±11.0aa 103±34aa 117±12aa固定配方組 4 132± 8.0 145±42b 168±29b牛 膝 組 4 152±21.3b 178±14bb 209±25bb獨 活 組 4 144±36.0 166±13b 189±19正常組b

3 討論

補氣生骨方(黃芪、白芷、穿山甲、何首烏)中的黃芪甘溫可益氣生血為主藥;白芷性溫可散風祛濕、通竅止痛;穿山甲咸寒入肝經可解痙攣、止疼痛、祛風通絡;何首烏甘苦可補肝腎、強筋骨、益精血，諸藥結合使用，具有補氣養血、通絡除痹的功效［7］。引經藥具有一定的向導作用［8］，牛膝所含的化學活性物質多，藥理作用較多，作為引經藥具有活血下行的功效，可補肝腎、強筋骨，改善缺血狀態，促進骨組織修復［9］。股骨頭壞死是一種缺血性壞死，其病變與血管及血液運輸密切相關，而VEGF是目前所知惟一特異性作用于血管內皮細胞誘導血管新生的生長因子［10-11］，同時VEGF可誘導成骨細胞增殖，促進骨修復［12-13］。有研究證明，血清中的IGF-1作用于骨細胞內的內皮生長因子，從而促進其增殖，并加快新生血管的生長，對軟骨細胞的分裂增殖與功能代謝也有影響［14-15］。

為探討中藥配方及引經藥對股骨頭壞死的作用及機制，本研究以單獨補氣生骨方中藥及引經藥獨活為對照，進行組織病理學觀察及一些指標測定。結果表明，補氣生骨方對早中期股骨頭壞死具有一定的預防及緩解作用，加入引經藥牛膝和獨活后其作用增強，表現為骨小梁間隙降低，厚度和體積有所增加，骨細胞、軟骨細胞和血管數量等增多。通過測定血清中IGF-1含量以及VEGF的表達水平發現，補氣生骨方加引經藥牛膝可明顯提高 IGF-1及VEGF水平，從而刺激血管新生，促進骨細胞增殖和分化，對股骨頭壞死起到一定的修復作用。牛膝引導各中藥成分充分發揮作用，與引經藥獨活相比，其引導作用更強。

綜上所述，補氣生骨方加引經藥牛膝可通過提高血清中IGF-1含量以及VEGF的表達水平來促進股骨頭的壞死，其中引經藥牛膝對于藥物作用的發揮起到了重要的引導作用。

［1］Nelson T J， Martinez-Fernandez A， Terzic A. Induced pluripotent stem cells:developmental biology to regenerative medicine［J］.Nat Rev Cardiol，2010，7(12):700.

［2］Wakaba F，Uikihiro F，Toshikazu K，et al.Nationwide epidemiologic survey of idiopathic osteonecrosis of the femoral head［J］.Clin Orthop Relat Res，2010，10:2715-2724.

［3］陳述祥，董瑞.成人股骨壞死的評價與治療進展［J］.中國矯形外科志，2011，19(18):1529-1531.

［4］王冬雪，馬麗.股骨頭壞死的中醫辨證及治療進展［J］.世界中西醫結合雜志，2008，3(12):747-749.

［5］孔祥英，田能，等.活骨Ⅱ方加不同引經藥對股骨頭壞死兔股骨頭內血管內皮生長因子表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18(8):237-241.

［6］趙同生，馮德春.中藥治療缺血性股骨頭壞死22例［J］.河南中醫，2010，30(11):1096.

［7］孫德成.股骨頭壞死的中醫治療方法與預防［J］.中國醫藥指南，2013，1(11):266-267.

［8］趙炳辰.引經藥及其配伍規律研究［J］.亞太傳統醫藥，2014，10(6):58-59.

［9］單瑋，闕華發.三妙丸類方及川牛膝對急性痛風性關節炎大鼠炎癥反應的作用機制研究［J］.2013，8(2):189-193.

［10］Liu B，Li X，Liang G，et al.VEGF expression in mesenchymal stem cells promotes bone formation of tissue-engineered bones［J］.Mol Med Report，2011，4(6):1121.

［11］Zhao Q，Sun C，Xu X，et al.CD34+cell mobilization and upregulation of myocardial cytokines in a rabbit model of myocardial ischemia［J］.Int J Cardiol，2011，152(1):18.

［12］Tang J M，Wang J N，Zhang L，et al.VEGF/SDF-1 promotes cardiac stem cell mobilization and myocardial repair in the infarcted heart［J］.Cardiovasc Res，2011，91(3):402.

［13］Deike Varoga，Wolf Drescher，et al.Differential expression of vascular endothelial growth factor in glucocorticoid-related osteonecrosis of the femoral head［J］.Clinical Orthopaedics and Related Research，2009，467(12):3273-3282.

［14］Lara Longobardi，Lynda O'Rear，et al.Effect of IGF-1 in the Chondrogenesis of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell in the Presence or Absence of TGF-β Signaling［J］.J Bone Miner Res，2006，21(4):626-636.

［15］Chen X C，Weng X，et al.Relationships among magnetic resonance imaging，histological findings，and IGF-I in steroidinduced osteonecrosis of the femoral head in rabbits［J］.Journal of Zhejiang University SCIENCE B，2008，9(9):739-746.

Effects and Mechanism Research on the Fixed Recipe Plus Channel Ushering Drug of Achyranthes Bidentata on the Prevention and Treatment of Rabbit Femoral Osteonecrosis

SHANG Zhen，CHENG Jian-shu
(No.People's Hospital Jinan City，Shandong Province，Jinan 250101，China)

Objective:To study the effect and mechanisms of fixed formula with channel ushering drug-achyranthes on the osteonecrosis of the femoral head.Methods:The hormone-induced osteonecrosis of femoral head model was made by Escherichia coli endotoxin and hydrogenated prednisolone in rabbits，and they were treated with replenishing Qi and producing bone formula combining with different channel ushering drugs-achyranthes and pubescent angelica.The vascular distribution and histopathological changes were observed，the level of IGF-1 in serum and the expression of VEGF were detected.Results:The vascular area of achyranthes group was increased and was significantly different when compared with model group at the 2nd，4thand 8thweeks.It was also higher than the fixed formula group and pubescent angelica group.Histopathological observations showed that the mean space of trabecular bone reduced and thickness and volume increased.The ratio of empty lacuna declined significantly when compared with model group，and was smaller than fixed formula group and pubescent angelica group.The level of IGF-1 in serum and the expression of VEGF were increased significantly.Conclusion:The fixed formula with achyranthes can promote the healing of osteonecrosis of the femoral head by increasing the levels of IGF-1 in serum and the expression of VEGF，in which the channel ushering drug achyranthes plays an important guiding role.

Channel ushering drug;Achyranthes;Osteonecrosis of the femoral head

R683.41

:B

:1006-3250(2015)07-0803-03

2015-05-19

商 震(1974-)，男，主治醫師，醫學碩士，從事骨外科的臨床與研究。