槲皮素對糖尿病大鼠腎臟保護機制的研究*

常陸林，劉春杰，王興紅△，李海霞

(1.漯河醫學高等專科學校基礎醫學部，河南漯河 462000; 2.新疆醫科大學第一附屬醫院，烏魯木齊 830054)

槲皮素對糖尿病大鼠腎臟保護機制的研究*

常陸林1，劉春杰1，王興紅1△，李海霞2

(1.漯河醫學高等專科學校基礎醫學部，河南漯河 462000; 2.新疆醫科大學第一附屬醫院，烏魯木齊 830054)

目的:觀察槲皮素對糖尿病大鼠腎臟的保護作用并初步探討其作用機制。方法:制備糖尿病大鼠模型，按隨機數字表法分為正常對照組、糖尿病模型組以及槲皮素組，8周后測定各組大鼠血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24 h尿蛋白、腎臟肥大指數、腎內超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量;Western blot測定腎內單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的含量，酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)，光鏡觀察腎小球病理形態學變化。結果:與模型組比較，槲皮素組大鼠血BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎臟肥大指數、血清IL-6、TNF-α、hs-CRP，PAI-1及腎內MDA和MCP-1表達均明顯降低，腎內SOD活力明顯升高，且明顯改善腎小球病理變化。結論:槲皮素能改善糖尿病早期腎功能，其機制可能與改善氧化應激和抗炎的作用有關。

糖尿病腎病;槲皮素;單核細胞趨化蛋白-1;氧化應激;炎癥

目前，糖尿病腎病(DN)是國內外糖尿病患者的嚴重微血管病并發癥之一，其發病機制和有效防治措施一直是醫學界研究的焦點。近年來，不少學者在探索DN的病因時提出了“炎癥發病機制”和抗炎治療措施。槲皮素(Quercetin，Que)是一種天然的黃酮類化合物，因其具有廣泛的藥理作用而愈來愈受到人們的重視，是具有多靶點作用和綜合治療優勢的中藥單體。本課題組既往研究Que對缺血再灌注損傷心肌具有抗氧化抗炎的保護作用［1］。有研究表明［2］，Que對大鼠慢性腎功能衰竭具有防治作用，但機制尚未明確，我們推測它對DN可能有防治作用。本研究旨在觀察Que對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠氧化應激和炎癥影響，揭示其是否對DN有保護作用，進一步為Que防治DN的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年清潔級健康雄性SD大鼠，體質量300～350 g，由河南省實驗動物中心提供(合格證號410117)。

1.1.2 藥物和試劑 槲皮素(批號100123，美國Sigma公司);鏈脲佐菌素(批號090412，美國Sigma公司);丙二醛(批號091103)、超氧化物歧化酶(批號091221)、白細胞介素6 ELISA試劑盒(批號090211)、超敏C反應蛋白ELISA試劑盒(批號090111)、纖溶酶原激活物抑制劑1 ELISA試劑盒(批號080211)均購自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子 αELISA試劑盒(批號 090521，德國Siemens公司);MCP-1小鼠抗大鼠單克隆抗體(批號100911，美國 Santa Cruz公司);β-actin(批號100122，北京博奧森生物公司)。

1.1.3 主要儀器 三諾SXT-1型快速血糖測定儀(長沙)，UV-7501紫外分光光度計(無錫科達儀器廠)，全自動酶聯免疫吸附儀(芬蘭 Thermo Labsytom)，CM1900-1-1恒冷箱冰凍切片機(德國Leica)，倒置光顯微鏡(德國 Leica)，Power-pac200電泳儀(美國BIO-RAD公司)，Trans-Blot電泳濕轉儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立、分組與給藥 成年健康雄性SD大鼠30只適應性喂養1周后，隨機抽取20只稱量體質量，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg。注射前動物禁食12 h，不禁水。注射后48 h尾靜脈取血測定血糖，以血糖≥16.65 mmol/L為糖尿病大鼠。余10只正常對照組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。實驗大鼠按隨機數字表法分為正常對照組(A)、糖尿病模型組(B)和槲皮素組(C)(50 mg/kg· d，臨用前用生理鹽水配成含槲皮素10 g/L的溶液)灌胃治療8周。正常組和糖尿病模型組按體質量換算等體積生理鹽水灌胃8周。全部大鼠常規飼料喂養，自由飲水。在實驗過程中由于模型組2只大鼠因高血糖死亡，最終28只完成實驗，其中正常對照組10只，模型組8只，槲皮素組10只。

1.2.2 標本采集與處理 實驗結束前1 d大鼠置代謝籠內收集24 h尿并計算尿量;動物麻醉稱重，心臟采血，離心后-70℃保存備用;并立即處死大鼠，剖腹取雙側腎臟標本，用濾紙吸干水分去包膜、稱重，計算腎臟肥大指數(腎臟肥大指數=雙側腎質量/體質量×%)。右腎-70℃凍存備用;左腎固定、石蠟包埋，做4 μm厚度非連續切片，進行HE染色，光鏡下觀察腎小球病理形態學變化。

1.2.3 血糖測定 尾靜脈取血后采用快速血糖儀測定。

1.2.4 血BUN、Scr及24 h尿蛋白測定 用OLYMBUSAU-600全自動生化分析儀測BUN、Scr，采用雙縮脲法測定24 h尿蛋白含量，以上均由漯河市中心醫院檢驗科測定。

1.2.5 血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1檢測

取已備血清，通過自動酶免分析儀測定血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1水平，在550 nm光下讀取OD值，應用標準曲線計算含量。操作嚴格按照相應的ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.6 腎組織MDA、SOD檢測 取右腎用冰冷生理鹽水清理血跡，用濾紙吸干，取組織約150 mg，置于2.0 mL玻璃勻漿器中制備10%的組織勻漿，離心(2500 r·min-1離心10 min)取上清放置4℃備用。MDA、SOD測定應用紫外分光光度計，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.7 Western blot測定腎臟內MCP-1的含量

取右腎組織用苯甲基磺酰氟攝取蛋白質，用BCA法測定總蛋白含量。蛋白樣品行10%SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜上封閉，加入一抗［MCP-1小鼠抗大鼠單克隆抗體(1∶1000)］，4℃過夜，傾去一抗，TBST洗膜3次，每次15 min。洗滌后二抗孵育［羊抗小鼠抗體(1∶5000)］，置于搖床上搖動，室溫下1 h棄去二抗，TBST洗膜3次，每次15 min;ECL發光劑暗室曝光成像、拍照，IMAGE J軟件分析求得平均光密度值(IOD)。

1.2.8 統計學方法 應用SPSS 16.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

與正常對照組大鼠比較，建立的糖尿病模型大鼠出現多飲、多尿、多食的癥狀，毛發色澤黯淡，精神萎靡，活動減少，隨著病程延長，除大鼠體質量呈下降趨勢外，其他癥狀更加明顯;與糖尿病模型組比較，槲皮素治療8周后，上述癥狀體征得到改善。

2.2 HE染色觀察腎小球病理形態學

圖1顯示，正常對照組腎小球大小較一致，腎小球結構清晰，基底膜未見明顯增厚，系膜區基質未見增多，系膜細胞及內皮細胞未見增多，符合正常大鼠處死后的腎小球結構特點;糖尿病模型組腎小球體積增大呈分葉狀，腎小球血管壁可見玻璃樣變性，基底膜輕度增厚，系膜基質輕度增多;槲皮素治療8周后腎小球體積減小，血管壁變性減輕，細胞形態基本正常，較模型組病理改變明顯減輕。

圖1 各組大鼠腎小球病理形態學變化(HE染色，×400)

2.3 血BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎臟肥大指數

表1顯示，與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠血BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎臟肥大指數顯著升高(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，槲皮素組大鼠血BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎臟肥大指數顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 藥物干預8周不同組別血BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎臟肥大指數比較

2.4 血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1含量

表2顯示，與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1含量顯著升高(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，槲皮素組大鼠血清上述炎癥因子顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 藥物干預8周不同組別血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1含量比較

2.5 腎組織MDA、SOD含量

表3顯示，與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠MDA水平顯著升高(P＜0.05)，SOD活性顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，槲皮素組大鼠MDA水平顯著降低(P＜0.01)，SOD活性顯著升高(P＜0.05)。

表3 藥物干預8周不同組別腎組織MDA、SOD含量和MCP-1蛋白表達比較

2.6 Western blot檢測MCP-1腎組織蛋白表達

圖2表3顯示，與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠腎內MCP-1蛋白表達顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，槲皮素組大鼠腎內MCP-1蛋白表達顯著降低(P＜0.01)。

圖2 各組大鼠腎臟MCP-1蛋白表達的變化(Western blot檢測)

3 討論

目前糖尿病腎病(DN)的發病機制尚未闡清，在已知DN發生發展的病理生理機制中，氧化應激和炎癥反應均起著十分重要的作用［3］。腎臟是氧化應激高度敏感的器官之一。越來越多的研究表明，在糖尿病狀態下，腎組織中氧化應激水平和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達呈明顯相關關系，腎組織中過量產生的活性氧簇(ROS)可能是MCP-1高表達的刺激因素。MCP-1為目前DN炎癥發病機制學說中研究的熱點和焦點，具有發動炎癥反應、促進腎小球系膜細胞增生、介導單核細胞產生細胞因子、表達黏附分子等多種生物效應。MCP-1可促進白細胞介素-1、6(IL-1和IL-6)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)等炎癥介質的釋放;引發氧化應激，激活蛋白水解酶，增加氧自由基的生成，損傷血管內皮細胞;激活單核細胞加劇炎癥，刺激系膜細胞分泌Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、纖維連接蛋白導致腎小球硬化［4-5］，因此干預MCP-1表達已成為治療DN的重要手段。目前研究認為，炎癥因子已成為DN持續發展過程中的重要危險因素［6］。本研究也證實，糖尿病模型大鼠循環血中炎癥因子 IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1和腎組織中MCP-1蛋白表達增多。經Que治療后，大鼠腎組織中MCP-1蛋白表達和血清炎癥因子IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1明顯降低，提示Que對糖尿病狀態下的低度炎癥反應有明顯的抑制作用，顯示其抗炎作用。

DN因其高致殘率和高致死率一直是醫學界研究防治的熱點。近10多年來，我國中醫藥界廣泛開展了中醫藥防治DN的研究，并逐漸顯示出較大的潛力和廣闊的應用前景［7］。Que是一種天然的黃酮類化合物，存在于多種植物的花、葉、果實中，具有抗氧化、抗炎、抗黏附、抗血栓、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂、降低血壓以及免疫調節作用［8-9］。課題組前期研究Que可以降低腎組織MDA含量，提高SOD活力并減少BUN、Scr、24 h蛋白尿，抑制腎內一氧化氮合酶活性和NO水平，抑制糖尿病腎臟早期的高灌注、高濾過，延緩DN的發生發展，發揮保護糖尿病腎臟的作用［10］。高糖環境下，氧化應激和炎癥反應在DN的進展中互為因果關系，加重腎臟的損害。本研究在前期研究基礎上進一步探討Que對DN保護作用機制。Que作為一種有效的抗氧化和抗炎劑，對DN的發展起到一定的抑制作用，其機制很可能是通過抑制氧化應激、增強抗氧化能力，從而抑制腎內MCP-1的表達。MCP-1可以促進循環血中炎癥因子IL-6、TNF-α、hs-CRP、PAI-1等的釋放。本研究顯示，Que能抑制以上炎癥因子的水平，我們推測這種抑制改變可能是Que通過抑制腎內MCP-1的表達從而降低腎組織低度炎癥反應，發揮抗纖維化作用，從而產生對腎組織和腎功能的保護作用。綜上研究提示，對于糖尿病腎損傷大鼠，Que可能通過改善氧化應激和抗炎的作用機制，發揮對早期DN的保護作用。Que有望成為DN防治的有效藥物，其臨床療效和具體的作用途徑還有待于進一步的驗證和研究。

［1］王興紅，鄭亞萍，李海霞.槲皮素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(4):266-270.

［2］李列平，李雄，彭自全，等.槲皮素對大鼠慢性腎功能衰竭及促紅細胞生成素水平的影響［J］.中國醫院藥學，2004，24 (7):412-413.

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［4］Woolf AS，Gnudil，Long DA.Roles of angiopoietins in kidney development and disease［J］.Am Soc Nephrol，2009，20(2): 239-244.

［5］JA Jefferson1，SJ Shankland，RH Pichler.Proteinuria in diabetic kidney disease:A mechanistic viewpoint［J］. Kidney International，2008，74:22.

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Protective Mechanism of Quercetin on Kidney in Diabetic Rats

CHANG Lu-lin1，LIU Chun-jie1，WANG Xing-hong1△，LI Hai-xia2
(1.Luohe Medical College，Henan，Luohe 462000，China; 2.The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

Objective:To observe the protective role of Quercetin on diabetic rats’kidney and explore its mechanism.Methods:The model of diabetic rats was made.The rats were randomly divided into three groups:normal group，diabetic model group，and Quercetin group.The serum creatinine(Scr)，blood urea nitrogen(BUN)，24 h urine protein，kidney hypertrophy index，the vitality of superoxide dismutase(SOD)and the content of malondialdehyde(MDA)in kidney of each group were measured.The monocyte chemoattractant protein 1(MCP-1)was measured by western blot.The serum interleukin 6(IL-6)，tumor necrosis factor(TNF alpha)，hypersensitive c-reactive protein(hs-CRP)and fibrinolytic enzyme activators inhibitor 1(PAI-1)were detected with the ELISA method.Results:Compared with the model group，the BUN，Scr and 24 h urine protein，and kidney’s hypertrophy Index of the serum of the rat in Quercetin group were significantly reduced.The IL-6，TNF-α，hs-CRP，PAI-1，MDA in the kidney，MCP-1 protein were significantly reduced，and SOD’s viability was significantly lowered，so the differences were statistically significant，and the glomerular pathological morphology was significantly improved.Conclusion:Quercetin can improve earlier diabetic kidney，and its mechanism may be related to improve oxidative stress and anti-inflammatory effect.

Diabetic nephropathy;Quercetin;MCP-1;Oxidative stress;Inflammation

R587.1

:B

:1006-3250(2015)07-0816-03

2015-03-04

漯河醫學高等專科學校校級自然科學研究資助項目(2013-S-LMC24);河南省教育廳高等學校重點科研項目(15B180011)

常陸林(1979-)，男，湖北宜昌人，講師，醫學碩士，從事黃酮類化合物藥理活性研究。

△通訊作者:王興紅(1981-)，女，山東臨沂人，講師，醫學碩士，從事糖尿病腎病的發病機制與防治研究，Tel: 15839575585，E-mail:xinghong0124@163.com。