左金方配方顆粒劑與傳統湯劑誘導人胃癌細胞SGC-7901凋亡的作用比較*

周紅祖，余惠旻

(1.深圳市中醫院，廣東深圳 518020;2.深圳大學醫學院，廣東深圳 518060)

左金方配方顆粒劑與傳統湯劑誘導人胃癌細胞SGC-7901凋亡的作用比較*

周紅祖1，余惠旻2△

(1.深圳市中醫院，廣東深圳 518020;2.深圳大學醫學院，廣東深圳 518060)

目的:比較左金方配方顆粒劑與傳統湯劑對人胃癌細胞SGC-7901生長的活性抑制和凋亡誘導作用。方法:采用MTT比色法觀察SGC-7901生長受抑制情況，流式細胞儀分析細胞凋亡率，Hoechst 33258染色觀察細胞形態學變化。結果:左金方配方顆粒劑與傳統湯劑分別作用SGC-7901細胞后均能抑制細胞活性，且與劑量、時間呈依賴關系，并可誘導SGC-7901的凋亡。結論:同一濃度的左金方配方顆粒劑與傳統湯劑作用SGC-7901相同時間，左金方配方顆粒劑比傳統湯劑的作用效果更為明顯。

左金方顆粒劑;左金方傳統湯劑;SGC-7901;凋亡

幾千年來，中藥都采用“飲片入藥、臨用煎湯”的用藥方法，近年來出現了一種新型、快捷、方便的劑型即中藥配方顆粒［1］。對我院2007至2014年中藥配方顆粒的使用情況進行初步統計，結果顯示其年均銷售增長速度為44%左右，中藥配方顆粒在臨床應用不斷擴大。學術界對中藥配方顆粒的認識尚未完全統一，中藥配方顆粒劑混合使用與傳統湯劑理論一直是中藥臨床應用中的一個爭議比較大的問題［2］。左金方是出自《丹溪心法》的名方，由黃連和吳茱萸按6∶1組成。本文從細胞凋亡學的角度，采用MTT比色法觀察細胞的生長受抑制情況，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，結合Hoechst染色后凋亡細胞的形態學變化，探討左金方配方顆粒劑與傳統湯劑誘導人胃癌細胞SGC-7901凋亡的作用差異，為左金方配方顆粒劑的臨床應用提供新的實驗依據，對指導中醫臨床用藥具有現實意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2培養箱(美國Shella公司);DC300型倒置熒光相差顯微鏡(德國Leica公司);超凈工作臺(比利時Esco公司);Rotofix32型離心機(德國Hettich公司);AllegraTM21R型低溫離心機(美國Coulter公司);Epics XL型流式細胞儀(美國 Coulter公司); Polar star Galaxy型酶標儀(德國BMG公司)。

1.2 試藥

黃連、吳茱萸均購于深圳華輝藥業有限公司，由深圳市中醫院中藥科劉志誠主任藥師鑒定為正品。黃連、吳茱萸配方顆粒劑均購自江陰天江藥業有限公司(產品批號1207156、1205167，有效期至2015年6月)。MPP+、MTT、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、RNA酶(RNase)均購自美國Sigma公司; 1640培養基、胰酶(trypsin，美國Gibico公司);胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司);Hoechst 33258(瑞士Fluka公司)。

1.3 細胞

人胃癌細胞株SGC-7901購自中山大學醫學院動物細胞中心(細胞源自美國ATCC細胞庫)。

2 方法

2.1 藥物制備

左金方傳統湯劑凍干粉:取30 g黃連與5 g吳茱萸，加8倍蒸餾水浸泡30 min，加水煎煮3次，每次30 min，過濾、合并3次濾液冷凍干燥。左金方傳統湯劑水提物凍干粉，每克干粉含生藥3.98 g;左金方配方顆粒劑中，黃連、吳茱萸顆粒劑均為1 g相當于飲片6 g。1.0 mg·mL-1左金丸傳統湯劑相對應的左金方配方顆粒劑濃度為0.66 mg·mL-1。

2.2 細胞培養

SGC-7901人胃腺癌細胞株在10%小牛血清RPMI1640培養液中，于 37℃條件下，在濕度為100%、含CO2為5%(體積分數)的CO2培養箱中常規培養。

2.3 實驗分組

將實驗分為正常對照組、左金方傳統湯劑(高、中、低劑量組)及相應的左金方配方顆粒劑(高、中、低劑量組)7組。

2.4 觀察指標和方法

2.4.1 MTT法測定細胞存活率 取對數生長期細胞，用 RPMI1640培養基制成細胞懸液(5× 104/mL)加入96孔板，100 μL/孔，培養24 h后給藥，實驗組分別加入不同濃度供試藥物，分別培養12、24、36、48、60、72 h加入MTT 10 μL/孔培養4 h，吸去培養基，加入DMSO 150 μL/孔，震蕩10 min。波長490 nm測吸光值(OD)。細胞抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

2.4.2 Hochest染色-熒光顯微鏡觀察 將SGC-7901細胞(2×105/mL)接種于6孔板內的蓋玻片上，各實驗組按要求給予不同的處理因素后，加入新鮮配制的4%多聚甲醛(pH為7.4)，于37℃固定細胞30 min，PBS液洗2次，加5 mg/L Hochest 33258染色液染色30 min，PBS液洗后，用封片液(20 mmol/L檸檬酸，50 mmol/L磷酸氫二鈉，50%甘油，pH 5.5)封片后熒光顯微鏡觀察、攝片。

2.4.3 流式細胞儀檢測 調整細胞密度為2 ×105/mL，以1.5 mL/well種入6孔板，每組6個復孔。藥物作用72 h后，細胞刮刮取細胞，1000 r/min離心10 min，去上清PBS漂洗2次，沉淀中緩慢依次加入70%的冰乙醇固定，-20℃固定24 h。固定后1000 r/min離心10 min，去上清PBS漂洗2次，調整細胞濃度為1×106/mL。加RNase至終濃度100 μg/mL，37℃水浴30 min。加PI至終濃度50 μg/mL，350目尼龍網濾膜過濾去除細胞團塊，4℃避光染色30 min后，上流式細胞儀檢測各期細胞DNA的含量(激發波長488 nm，發射波長610 nm)。測定數據按流式細胞儀所配置的軟件進行數據處理，以DNA組方圖出現低于G1期DNA含量的亞G1峰大小代表凋亡細胞的多少。

2.4.4 統計學方法 采用 SPSS 1010統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差 (±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 左金方配方顆粒劑與傳統湯劑對SGC-7901抑制率的影響

MTT實驗結果顯示，對照組細胞生長良好，經左金方配方顆粒劑與傳統湯劑作用24、48、72 h后的細胞，隨著給藥濃度的逐漸增高，作用時間不斷延長，SGC-7901細胞生長受抑制程度逐漸增強，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。表1顯示，相同濃度下左金方顆粒劑對細胞的抑制作用強于左金方傳統湯劑。如0.660 mg·mL-1左金方顆粒劑作用SGC-7901細胞24、48、72 h的抑制率分別為(17.9±3.1)%、(77.4±1.9)%和(90.7±4.5)%，與相應濃度(1.0 mg·mL-1)的左金方傳統湯劑比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

表1 左金方傳統湯劑與顆粒劑對SGC-7901生長抑制率的影響

3.2 左金方配方顆粒劑與傳統湯劑誘導人胃癌細胞SGC-7901凋亡的作用

凋亡細胞在流式細胞儀直方圖上可以出現特征性的亞二倍體峰(sub-G1 peak)，對照組自然凋亡率(1.69±1.91)%，不同濃度左金方配方顆粒劑與傳統湯劑作用24、48、72 h的細胞后，隨著給藥濃度的逐漸增高，作用時間的不斷延長，SGC-7901細胞的凋亡率逐漸增大，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。表2顯示，等效濃度的左金方顆粒劑誘導SGC-7901細胞凋亡的作用大于左金方傳統湯劑，如0.1、0.5和1.0 mg·mL-1左金方傳統湯劑作用于 SGC-7901細胞 48 h，細胞凋亡率分別為(11.60±1.24)%、(21.80±0.28)%、(36.40± 1.59)%，對應濃度(0.066、0.330和 0.660 mg· mL-1)的左金方配方顆粒劑分別為(17.70± 0.36)%、(30.40±1.20)%、(45.40±0.38)%，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)(圖1)。流式細胞儀的檢測結果說明，左金方配方顆粒劑與傳統湯劑均能誘導人胃癌細胞SGC-7901的凋亡，但左金方配方顆粒劑誘導凋亡的作用明顯優于左金方傳統湯劑。

表2 左金方傳統湯劑與顆粒劑對SGC-7901細胞凋亡的影響

圖1 不同濃度左金配方顆粒劑與傳統湯劑對SGC-7901細胞凋亡的影響(n=6)

3.3 左金方配方顆粒劑與傳統湯劑對人胃癌細胞SGC-7901凋亡的形態學影響 ①倒置顯微鏡下觀察結果顯示，SGC-7901細胞在正常狀態下貼壁生長，呈橢圓形，少數呈圓形，長至緊密時呈多角形，其折光率高、胞體大。經1.0 mg·mL-1左金方傳統湯劑作用48 h后，細胞多皺縮變圓，折光率減弱，間距變大，有細胞脫落漂浮于培養液中，經0.66 mg·mL-1左金方配方顆粒劑作用48 h后，上述表現更明顯;②熒光顯微鏡觀察結果顯示，經Hoehest33258熒光染色后，熒光顯微鏡下見空白組SGC-7901細胞膜均完整，核形態飽滿，核質著色淺，密度均勻一致(見圖2A);1.0 mg·mL-1左金方傳統湯劑作用48 h后，細胞出現典型凋亡形態特征，即細胞膜皺縮，細胞核相對變小熒光明顯增強，成高度塊狀(見圖2C);0.66 mg·mL-1左金方配方顆粒劑作用48 h，細胞除上述特征外，可見凋亡小體數目明顯多于左金方傳統湯劑組(見圖2B)。

圖2 1.0 mg·mL-1左金丸傳統湯劑與對應濃度配方顆粒劑(0.66 mg·mL-1)對SGC-7901細胞形態學影響(×200)

4 討論

中藥配方顆粒在臨床的使用越來越廣泛，但學術界對其認識尚未完全統一，中藥傳統湯劑(合煎)與中藥配方顆粒劑混合使用(單煎)的等效性一直是爭議的焦點問題。盡管有研究［3-4］認為，無論是配方顆粒劑與湯劑的化學成分比較，還是藥效分析以及臨床治療作用的比較，均表明配方顆粒劑可與中藥湯劑相媲美，有些方面療效優于湯劑。但大多數研究［5］認為，合煎不僅僅是單味藥有效成分的簡單相加，并非所有的中藥復方均可以配方顆粒替代，復方藥物合煎與單煎的等效性還有待于嚴格的藥理學、化學、藥效學、臨床試驗等數據的支持。基于社會對中藥配方顆粒需求量越來越大，配方顆粒使用越來越廣泛的現狀，積極推動中藥合煎與單煎的等效性研究已成為當務之急。

本研究中MTT的結果顯示，隨著給藥濃度的逐漸增高，作用時間的不斷延長，SGC-7901細胞的生長受抑制的程度逐漸增強，相同濃度下，左金方顆粒劑對細胞的抑制作用強于左金方傳統湯劑(見表1);流式細胞儀分析結果進一步表明，相同條件下，等效濃度的左金方顆粒劑誘導SGC-7901細胞凋亡的作用大于左金方傳統湯劑，如0.1、0.5和1.0 mg ·mL-1左金方傳統湯劑作用于SGC-7901細胞48 h，細胞凋亡率分別為(11.60±1.24)%、(21.80± 0.28)%、(36.40±1.59)%，對應濃度(0.066、0.330和0.660 mg·mL-1)的左金方配方顆粒劑分別為(17.70±0.36)%、(30.40±1.20)%、(45.40±0.38)%，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)(見表2圖1);結合Hochest染色中凋亡細胞的形態學變化結果(圖2)，說明左金方配方顆粒劑誘導人胃癌細胞SGC-7901凋亡的作用優于左金方傳統湯劑。

以上研究為左金方配方顆粒劑的臨床應用提供了新的實驗依據，對指導中醫臨床用藥具有現實意義。

［1］田紅艷.淺析中藥配方顆粒的優勢［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2012，18(4):443.

［2］李長纓.中藥免煎顆粒的優勢與存在的問題［J］.現代醫藥衛生，2011，27(6):898.

［3］戴啟文，張鴻程，胡娟，等.淺談中藥配方顆粒劑與湯劑的比較研究［J］.中國民族民間醫藥，2011，10:18-19.

［4］唐翎，李新中，雷鵬，等.黃連解毒湯傳統飲片湯劑與配方顆粒湯劑藥效學對比研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21 (1):31-35.

［5］曾銳，祝勇軍，俞脈文，等.小青龍湯單味濃縮配方顆粒與傳統飲片臨床療效對比研究［J］.中國中醫急癥，2006，15 (11):1233-1234.

Function Comparison of Zuojinfang Granule and Traditional Decoction in Inducing Apoptosis of Human Gastric Cancer Cells SGC-7901

ZHOU Hong-zu1，YU Hui-min2△
(1.Shenzhen Chinese Medicine Hospital，Shenzhen 518020，China;2.School of Medicine，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China)

Objective:To compare the cellular growth inhibition and apoptosis of human gastric carcinoma cells SGC-7901 induced by compound granule and traditional decoction of ZuoJinFang.Methods:The growth inhibition of the SGC-7901 treated by compound granule and traditional decoction of ZuoJinFang were analyzed by MTT assay.The apoptosis rates of cell were studied by flow cytometry.Hoechst 33258 staining showed the cell morphology changes.Results:After the cells treated by compound granule and traditional decoction of ZuoJinFang，the cell survival rates decreased in a dose-timedependent manner.Conclusion:Compound granule and traditional decoction of ZuoJinFang significantly inhibited the growth of SGC-7901 and induced the cell apoptosis.While the effect of compound granule was stronger than and traditional decoction of ZuoJinFang under the same conditions.

Compound granule of ZuoJinFang;Traditional decoction of ZuoJinFang;SGC-7901;Apoptosis

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0833-04

2015-02-22

廣東省中醫藥局項目(20141253);深圳市戰略新興產業發展專項(JCYJ20130326112248968)

周紅祖(1971-)，女，新疆人，副主任藥師，醫學學士，從事中藥腫瘤藥理學及中藥學基礎研究。

△通訊作者:余惠旻(1972-)，男，新疆人，醫學博士，從事中藥及其復方抗腫瘤的臨床與研究，Tel:0755-86671902，E-mail:yuhuimin@szu.edu.cn。