姜黃素對心臟成纖維細胞增殖的研究

楊蕙宇

(西安醫學院臨床醫學院技能教研室，西安 710021)

姜黃素對心臟成纖維細胞增殖的研究

楊蕙宇

(西安醫學院臨床醫學院技能教研室，西安 710021)

目的:探究姜黃素在AngII誘導的心臟成纖維細胞大量增殖和CTGF、PAI-1過表達中的影響，探討姜黃素與心臟成纖維細胞增殖的關系。方法:心臟成纖維細胞原代的培養，分別用倒置顯微鏡及免疫組織化學法對原代心臟成纖維細胞進行監測，用MTT法測定不同濃度姜黃素(0～100 μmol/L)對心臟成纖維細胞活性的影響，用MTT法檢測不同濃度姜黃素對心臟成纖維細胞增殖能力的影響，用real-time PCR檢測CTGF、PAI-1mRNA，用western-blot法分析不同濃度姜黃素對各組心臟成纖維細胞CTGF、PAI-1表達的影響。結果:在0～60 μmol/L范圍內，姜黃素未顯示明顯的細胞毒性，因此在后續試驗中我們選擇5、10、30 μmol/L濃度姜黃素進行試驗，試驗說明姜黃素可以有效的抑制AngII誘導的心臟成纖維細胞增殖，并具有濃度依賴性，可以有效地抑制AngII誘導的CTGF和PAI-1表達。結論:姜黃素能夠有效地抑制AngII誘導的心臟成纖維細胞過度增殖和CTGF、PAI-1 mRNA與蛋白的過表達，從而起到抗增殖作用。

姜黃素;血管緊張素-II;心臟成纖維細胞;纖維化

姜黃素是一種天然色素類物質，富含于姜科植物塊莖中，是一種被廣泛使用的調味品。此外，很早姜黃素就被收入中國和印度的草本方劑中，用于治療多種疾病。現代醫學認為，姜黃素具有抗炎［1］、抗腫瘤、抗纖維化和心血管保護［2］等多種生物學效用。目前已有試驗證實，在多種常見致纖因素導致的肺部和腎臟等器官纖維化病變中，姜黃素均顯示出顯著的抗纖維化作用。Smith MR［3］等發現，姜黃素可以抑制肺部成纖維細胞的增殖，從而減輕博來霉素誘導的肺部纖維化。姜黃素還可以通過抑制TGF-β通路的激活和上調抗炎因子HO-1的表達，減輕腎臟纖維化的程度［4］。迄今為止，姜黃素對心臟纖維化的發病作用尚不明確。本研究我們擬在基因和蛋白的水平研究姜黃素對AngII誘導的心臟成纖維細胞增殖的能力，以探討姜黃素與心臟纖維化的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

出生1～2 d的SD大鼠雌雄不限，由西安交通醫學院醫學院實驗動物中心提供。姜黃素粉末純品購于美國Sigma公司，兔抗大鼠PAI-1多克隆抗體由美國Abcom公司提供，兔抗大鼠CTGF多克隆抗體由美國Santa Cruz公司提供。

1.2 研究方法

1.2.1 心臟成纖維細胞原代培養 選擇出生1～2 d的SD大鼠乳鼠15只分離心臟組織，4℃ DHanks中反復漂洗，摘取左心室部分約1～2 mm3大小的組織塊，用5 g/L的胰酶對其消化;采用差速貼壁法分離心臟成纖維細胞。使用3～7代的細胞進行實驗并用倒置顯微鏡對原代培養細胞進行鑒定，免疫組織化學法檢測。

1.2.2 姜黃素溶液配制 姜黃素粉末純品購于美國Sigma公司，使用DMSO溶解，制成10 mmol/ L保存濃度，放置于-20℃冰箱內長期儲存，使用時再稀釋成相應濃度。

1.2.3 細胞活性測定 取對數生長期、生長狀態良好的心臟成纖維細胞，以4×104個/mL濃度接種于96孔板中，每孔150 μL。細胞貼壁融合80%～90%后，以不同濃度(10、20、40、60、80、100 μmol/ L)的姜黃素處理24 h棄去培養液，每孔中加入MTT (5 mg/mL)20 μL，繼續孵育4 h，吸去上清液，每孔中再加入150 μL的DMSO溶解結晶顆粒，490 nm測定各組吸光度值(OD490)。以正常對照組細胞活力為100%，其余各組細胞活力按以下公式計算:活細胞率(%)=。

1.2.4 姜黃素對AngII刺激的心臟成纖維細胞增殖能力的影響 取對數生長期、生長狀態良好的CFs細胞，以4×104個/mL濃度接種于96孔板中，每孔150 μL。細胞貼壁融合為80% ～90%后，以不同濃度(5、10、30 μmol/L)的姜黃素預處理2 h，再改用AngII(100 nmol/L)孵育1～5 d。棄去培養液，每孔中加入MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續孵育4 h吸去上清液，每孔中再加入150 μL的DMSO溶解結晶顆粒，490 nm測定各組吸光度值(OD490)。以正常對照組細胞活力100%，按細胞活力公式計算:活細胞率(%)==97.91%。

1.2.5 熒光定量PCR(real-time PCR)反應引物設計:依據GenBank提供的大鼠CTGF、PAI-1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的核酸序列，使用Desiner V 4.0進行引物設計，由南京金絲瑞生物有限公司合成。引物序列 CTGF forward:5’-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3’;reverse:5’-AGCCCGGTAGGTCTTCACACTG-3’。GAPDH引物序列用于內對照:forward，5’-GACAACTTTGGCATC GTGGA-3’;reverse，5’-ATGCAGGGATGATGTTCT GG-3’。用上述引物進行PCR，95℃，5 min 95℃，15 s 55℃，15 s 72℃，30 s 45個循環。

1.2.6 蛋白免疫印跡實驗(Western-blot) 總蛋白提取:蛋白濃度測定SDS-PAGE電泳、制膠、加樣和電泳、轉膜，電泳結束后一抗孵育，4℃孵育過夜。二抗孵育使用TBST對PVDF膜進行清洗，每次8 min，共4次。配制相應二抗(1∶2000)，室溫下孵育2 h。化學發光使用Quantity One圖像分析軟件，對膠片進行灰度掃描，以control為對照，其他各組灰度按照control組倍數進行統計。

1.2.7 統計學方法 姜黃素組與對照組進行方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CFs細胞的鑒定

普通形態學和免疫組化法對原代CFs細胞進行檢測，CFs細胞纖維黏連蛋白染色陽性，在胞質有均勻分布的黃色絲狀物質。對CFs細胞進行肌動蛋白染色，無顯色現象。

2.2 不同濃度姜黃素對CFs細胞活性的影響

圖1顯示，為排除姜黃素可能的細胞毒性影響，我們使用 MTT法測定不同濃度姜黃素(0～100 μmol/L)對CFs細胞活性的影響。因此，在后續試驗中我們選擇5、10、30 μmol/L濃度姜黃素對CFs細胞進行干預。

圖1 不同濃度姜黃素對CFs細胞毒性的影響

2.3 不同濃度姜黃素對CFs細胞增殖能力的影響

圖2顯示，使用MTT法對各組細胞增殖能力進行檢查。結果提示，姜黃素可以有效地抑制AngII誘導的CFs細胞增殖作用。

圖2 不同濃度姜黃素對AngII刺激的CFs細胞增殖能力影響

2.4 不同濃度姜黃素對CFs細胞CTGF、PAI-1表達的影響

圖3顯示，由CFs細胞通過自分泌和旁分泌途徑釋放的CTGF和PAI-1，可以顯著增強自身及附近CFs細胞增殖和膠原分泌能力。結果提示，姜黃素可以有效抑制AngII誘導的CTGF和PAI-1表達，起到一定的抗增殖作用。

3 討論

在原發性高血壓、心肌梗塞、瓣膜性心臟病等常見心臟疾病的發展過程中，均伴有心臟纖維化的病理性改變。心臟成纖維細胞(CFs)的過度增殖和聚集、細胞外基質(ECM)的沉積是心臟纖維化的主要病理學特征。在心臟纖維化過程中，伴隨激素-體液內成分濃度的改變，致纖因子分泌顯著增加。AngII已被證實是強有力的致纖因子，據此本實驗中我們選取AngII對CFs細胞進行刺激。CTGF通過刺激CFs增殖、增加CFs細胞I和III型膠原分泌、增強細胞遷移等方式促進心臟纖維化的發展。PAI-1已被證實，可以通過增強TGF-β/Smad通路的磷酸化，增強腎小球細胞的增殖能力［5］。在心臟纖維化的動物模型中，也發現PAI-1的表達明顯升高。在肝臟、肺臟等器官的纖維化過程中，CTGF可以誘導處于原始狀態的多種間質細胞向成熟狀態發展［6-7］。

圖3 不同濃度姜黃素對CFs細胞CTGF和PAI-1 mRAN和蛋白表達的影響

現代醫學認為，姜黃素具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化和心血管保護等多種生物學效用。目前已經有試驗證實，在多種常見致纖因素導致的肺部和腎臟等器官纖維化病變中，姜黃素均顯示出顯著的抗纖維化作用。并通過上調 cathepsins K和 cathepsins L，抑制成纖維細胞增殖和遷移能力，增加成纖維細胞凋亡比例，從而減輕博來霉素誘導的肺部纖維化。在本次實驗結果中我們首次發現，姜黃素能夠顯著抑制AngII誘導的CFs細胞增殖能力，并具有濃度依賴性。此外，姜黃素還能減少CFs細胞CTGF和PAI-1分泌。這些結果提示，姜黃素對于可能對AngII誘導的心臟纖維化具有一定的抑制作用。

總之，姜黃素能夠顯著抑制AngII誘導的CFs細胞增殖能力，并具有濃度依賴性。此外，姜黃素還能夠抑制AngII誘導CFs細胞CTGF和PAI-1的分泌。這些結果提示，姜黃素對于可能對AngII誘導的心臟纖維化具有一定的抑制作用。此研究對心臟纖維化的預防與治療提供了新的觀點。

［1］Abe Y，Hashimoto S，Horie T.Curcum in inhibition of inflammatory cytokine production by human peripheral blood monocytes and alveolar macrophages［J］.Pharmacol Res，1999，39(1):41-47.

［2］孫秀才，馮建章，等.姜黃素對食高脂飼料家兔血管內皮功能的保護作用［J］.嶺南醫學雜志，2004，10(1):60-63.

［3］Smith MR，Gangireddy SR，Narala VR，Curcumin inhibits fibrosis-related effects in IPF fibroblasts and in mice following bleomycin-induced lung injury［J］.Lung，2010 May，298(5): L616-625.

［4］WANG Yan，ZHANG Bo，LI Jianhua.Mechanisms of Renal Protection of Curcumine:Research Advanc［J］.2009，35:1673-9701.

［5］Halleux CM，Declerck PJ，Tran SL.Hormonal control of plasminogen activator inhibitor-1 gene expression and production in human adipose tissue:stimulation by glucocorticoids and inhibition by catecholamines［J］.J Clin Endocrinol Metab，1999，11，84(11):4097-4105.

［6］Riser BL，Denichilo M，Cortes P，et al.Regulation of connective tissue growth factor activity in cultured rat mesangial cells and its expressionn in experimental diabetic glomerulosclerosis［J］.J Am Soc Nephrol，2000，11(2):25-38.

［7］Ball DA，Surveyor GA，Diehl JR，et al.Characterization of 16，20kilo-Dalton(kDa)connective tissue growth factors(CTGF)and demonstration of proteolytic activity for 38 kDa CTGF in pig uterine luminal flushings［J］.Biol Reprod，1998，59(7):828-836.

Influence of curcumin on proliferation of fibroblasts into heart

YANG Hui-Yu
(Clinical Medical College，Xi’an Medical University，Xi'an 710021，China)

objective:Explore curcumin proliferate and CTGF，PAI-1 overexpression in AngII-induced effects on cardiac fibroblasts.Explore the relationship between curcumin and the proliferation of cardiac fibroblasts.Method:The primary cultured cardiac fibroblasts，respectively by inverted microscope and immunohistochemical method for primary cardiac fibroblasts were monitored.Determined by MTT method is used to test different concentrations of curcumin(0～100 mu mol/L)effect on the activity of cardiac fibroblasts.The effect of different concentration of Cur(0～100 μmol/L)on the cell proliferation ability of cardiac fibroblasts was measured by MTT assay.The levels of mRNA and protein of CTGF，PAI-1，were measured by real-time PCR and western-blotting.Result:Curcumin exhibits no cellular toxicity on cardiac fibroblasts at the concentration between 0～60 μmol/L.In our study，we chose the concentration of 5，10，and 30 μmol/ L to treat the cell to observe whether curcumin can inhibit AngII-induced over-proliferation and overexpression of CTGF and PAI-1 in cardiac fibroblasts.Conclusion:Curcumin inhibits AngII-induced cardiac fibrosis by suppressing over proliferation and the overexpression of CTGF and PAI-1 in AngII-stimulated cardiac fibroblasts.

Curcumin;Angiotensin II;Cardiac fibroblast;Fibrosis

R543.23

:B

:1006-3250(2015)07-0869-03

2015-04-19

楊蕙宇(1984-)女，講師，醫學碩士，從事心血管內科疾病的教學與研究。