疏血通脈膠囊預處理對ERK信號通路的腦缺血耐受誘導作用調控研究*

劉 泰，黃德慶，張元侃，胡躍強，梁 妮，胡玉英，何乾超，陳榮群，張青萍

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023)

疏血通脈膠囊預處理對ERK信號通路的腦缺血耐受誘導作用調控研究*

劉 泰，黃德慶，張元侃，胡躍強，梁 妮，胡玉英，何乾超，陳榮群，張青萍△

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023)

目的:研究ERK信號通路在腦缺血耐受誘導中的作用，觀察疏血通脈膠囊預處理對其調控作用。方法:對大鼠行3 min腦缺血預處理，誘導其產生腦缺血耐受，24 h后建立腦缺血再灌注模型(缺血預處理組)，觀察ERK/P-ERK的變化情況，并與假手術組、缺血再灌注組、疏血通脈膠囊組及PD98059組進行比較，檢測各組神經元凋亡數量，觀察ERK/P-ERK與神經元凋亡的相關性。結果:缺血預處理組及疏血通脈膠囊組P-ERK表達水平均明顯上調，同時神經元凋亡數量減少，與缺血再灌注組比較差異有統計學意義。腹腔注射ERK抑制劑PD98059后，大鼠P-ERK表達水平受到明顯抑制，神經元凋亡數量增加，并加重神經功能缺損情況。結論:腦缺血預處理能夠減少腦缺血再灌注后神經元凋亡，改善神經功能，其機制可能與ERK信號通路激活有關，疏血通脈膠囊預處理可能通過激活該通路起到腦保護作用。

腦缺血預處理;腦缺血再灌注;疏血通脈膠囊;ERK信號通路

腦缺血耐受是一種強有力的內源性神經保護機制，可提高神經細胞對缺血性損害的抵抗力［1］。研究發現，中藥誘導腦缺血耐受形成有著獨到的優勢。疏血通脈膠囊是廣西中醫藥大學第一附屬醫院劉泰教授的經驗方，前期研究發現其對缺血性腦血管病有較好的療效［2-4］，但其預處理能否提高腦缺血耐受能力目前尚未明確。本研究以細胞外信號調節激酶(extracellular signa1-regulated kinases，ERK)為切入點，研究ERK信號通路在腦缺血耐受誘導中的作用，并觀察疏血通脈膠囊預處理對其的調控作用。

1 材料與方法

1.1 抗體和主要試劑

ERK1/2、P-ERK1/2(pTyr204/Thr202)抗體購自美國 Affinity公司，Tunel凋亡試劑盒購自德國Roche公司，蛋白酶K購自美國Sigma公司，PVDF膜購自Millipore公司，其余主要試劑購自碧云天生物公司。

1.2 實驗藥物

疏血通脈膠囊由三七15 g、薤白10 g、地龍10 g、栝樓皮10 g、冰片0.1 g等組成，藥物購自柳州神農醫藥公司，由廣西中醫藥研究院制備，每克含生藥5 g。ERK抑制劑PD98059購自美國Sigma。

1.3 模型建立與分組

健康成年雄性SD大鼠200只(許可證號sYXK桂2009-0002)，體質量220～250 g，按隨機數字表法分為假手術組、缺血再灌注組、預缺血組、疏血通脈組和PD98059組各40只。假手術組只分離動脈不插線;缺血再灌注組、疏血通脈組、PD98059組均參照改良Longa法［5］建立大腦中動脈閉塞再灌注模型。預缺血組大鼠先預缺血3 min，恢復灌注24 h后建立缺血再灌注模型。造模前，疏血通脈組參照《現代醫學實驗動物學》，按380 mg/kg制成混懸液灌胃;PD98059組以 1 mg/kg劑量腹腔注射PD98059，2組給藥均為14 d。其余3組給予等量蒸餾水灌胃，術中死亡大鼠及時補充。

1.4 取材與處理

術后清醒大鼠根據Zea Longa 5分制標準評分，再灌注后3 h、6 h、24 h、72 h按隨機數字表法分為4個亞組，每亞組10只大鼠，取大腦梗死區皮層，一部分放入-80℃冰箱保存，進行ERK、P-ERK檢測。另一部分置于4%甲醛溶液中固定保存，用于神經元凋亡檢測。

1.5 免疫印跡法檢測ERK、P-ERK的表達水平

每孔取20 μL蛋白樣品上樣行凝膠電泳，完成后進行轉膜，100 V恒壓進行45 min。TBS洗膜后，封閉液封閉1 h，加一抗4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次后，加二抗室溫孵育1 h。TBST再洗3次，超敏發光液反應1 min，壓片、顯影、定影，內參按此方法進行檢測。掃描條帶光密度值并進行分析，以P-ERK與ERK的比值(P-ERK/ERK)表示ERK磷酸化水平，即ERK通路激活程度。

1.6 TUNEL法檢測神經元凋亡

脫蠟后用4%的多聚甲醛室溫固定15 min，將組織切片放入0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液，置于微波爐加熱5 min至沸騰，室溫冷卻后PBS洗3次;加反應混合液37℃反應1 h，PBS室溫浸洗2次;加Converter-POD反應液37℃反應30 min;PBS室溫浸洗2次后加DAB顯色液室溫反應約10 min，沖洗后脫水、封片，400倍光鏡鏡檢。

1.7 統計學方法

使用SPSS 17.0進行統計分析，多組間均數比較采用單因素方差分析，方差齊則行LSD(L)檢驗，方差不齊則取Tamhane’s T2檢驗結果，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺損評分

表1顯示，除假手術組外，其余4組均出現不同程度的神經功能缺損并逐漸加重，于24 h達到高峰;預缺血組、疏血通脈組各時間點均輕于缺血再灌注組及PD98059組，差異有統計學意義(P＜0.05);同時，缺血再灌注組各時間點神經功能缺損均輕于PD98059組，差異有統計學意義(P＜0.05);預缺血組與疏血通脈組各時間點比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后各時間點神經功能缺損評分情況(±s)

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后各時間點神經功能缺損評分情況(±s)

注:與假手術組比較:*P＜0.05;與缺血再灌注組比較:△P＜0.05;與PD98059組比較:▲P＜0.05，☆P＜0.05

組別 例數3 h 6 h 24 h 72 h假 手 術 組10 0 0 0 0缺血 再灌 注 組 10 2.00±0.47＊☆ 2.20±0.63＊☆ 2.50±0.53＊☆ 2.30±0.48＊☆預 缺 血 組 10 1.10±0.32＊△▲ 1.50±0.53＊△▲ 1.70±0.48＊△▲ 1.30±0.48＊△▲疏 血 通 脈 組 10 1.20±0.42＊△▲ 1.30±0.48＊△▲ 1.60±0.52＊△▲ 1.10±0.32＊△▲PD 9 8 0 5 9組 10 2.50±0.53* 2.70±0.48* 2.90±0.32* 2.70±0.48*

2.2 免疫印跡檢測

表2圖1顯示，各組大鼠P-ERK/ERK情況，除假手術組及PD98059組外，其余各組從3 h即出現ERK通路的明顯激活并逐漸升高，于24 h達到高峰，各時間點與假手術組及PD98059組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。預缺血組、疏血通脈組各時間點磷酸化水平均高于缺血再灌注組，差異有統計學意義(P＜0.05)。各時間點預缺血組與疏血通脈組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠腦缺血再灌注后各時間點梗死區P-ERK/ERK情況(±s)

表2 各組大鼠腦缺血再灌注后各時間點梗死區P-ERK/ERK情況(±s)

注:與假手術組比較:*P＜0.05;與缺血再灌注組比較:△P＜0.05，;與PD98059組比較:▲P＜0.05，☆P＜0.05

組別 例數3 h 6 h 24 h 72 h假 手 術 組10 0.40±0.02 0.42±0.02 0.48±0.04 0.43±0.06 10 0.31±0.06 0.33±0.08 0.35±0.06 0.33±0.08缺 血 再 灌 注 組 10 0.81±0.12＊☆ 0.91±0.18＊☆ 1.31±0.14＊☆ 1.03±0.16＊☆預 缺 血 組 10 1.21±0.18＊△▲ 1.25±0.18＊△▲ 1.73±0.24＊△▲ 1.55±0.09＊△▲疏 血 通 脈 組 10 1.16±0.17＊△▲ 1.32±0.19＊△▲ 1.84±0.20＊△▲ 1.63±0.22＊△▲PD 9 8 0 5 9 組

圖1 24 h各組P-ERK以及ERK的表達情況

2.3 神經元凋亡情況

圖2顯示，各時間點假手術組偶見極少量凋亡細胞，其余各組隨腦缺血再灌注時間的延長，凋亡數量逐漸增加，并于24 h時達到高峰，預缺血組與疏血通脈組各時間點神經元凋亡數量均較缺血再灌注組少，差異有統計學意義(P＜0.05)，但預缺血組與疏血通脈組比較差異無統計學意義(P＞0.05); PD98059組各時間點神經元凋亡數量均多于缺血再灌注組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠神經元凋亡情況(±s)

表3 各組大鼠神經元凋亡情況(±s)

注:與假手術組比較:*P＜0.05;與缺血再灌注組比較:△P＜0.05;與PD98059組比較:▲P＜0.05，☆P＜0.05

組別 例數3 h 6 h 24 h 72 h假 手 術 組 10 2.40±0.52 2.50±0.53*2.00±0.82 2.10±0.74缺 血 再 灌 注 組 10 21.00±4.77＊☆ 26.60±7.09＊☆ 82.60±9.56＊☆ 68.3±9.52＊☆預 缺 血 組 10 14.00±4.35＊△▲ 20.30±4.83＊△▲ 47.30±7.30＊△▲ 42.90±5.20＊△▲疏 血 通 脈 組 10 15.80±5.09＊△▲ 18.20±5.29＊△▲ 45.30±6.93＊△▲ 40.40±6.08＊△▲PD 9 8 0 5 9 組 10 36.20±6.12* 43.60±6.17* 98.60±8.77* 79.90±9.16*

圖2 24 h時間點各組神經元凋亡情況

3 討論

ERK是絲裂酶原活化蛋白激酶家族的一員，ERK激活后可降低腦缺血再灌注損傷NMDA受體活性，抑制Ca2+內流，發揮神經元保護作用［6］。本研究結果提示，腦缺血預處理可明顯減少大鼠腦缺血再灌注后神經元凋亡數量，改善神經功能，有明確的腦保護作用。同時我們觀察到，預缺血組大鼠ERK信號通路被激活，表現為P-ERK/ERK比值顯著上升，并于24 h時達到高峰，72 h仍可觀察到明顯的磷酸化表達，這與國外文獻報道結果是一致的［7］。而ERK抑制劑PD98059可使大鼠P-ERK表達水平受到明顯抑制，神經元凋亡數量增加，并加重神經功能缺損。本研究發現，ERK激活具有神經保護作用，抑制ERK磷酸化加重了神經功能缺損情況，提示腦缺血耐受的產生與ERK通路的激活有關，腦缺血再灌注后該信號通路的激活可能是機體應激時的自身保護反應。

缺血性腦血管病屬于中醫學“中風”范疇，劉泰總結前人經驗及結合自己的經驗，認為“痰瘀互結”是中風病的關鍵病機，因此提出“化痰祛瘀”法是缺血性腦血管病防治的重要治法［8-9］，并自擬疏血通脈膠囊治療中風，方中三七、薤白為君藥，化痰祛瘀通絡;地龍、栝樓皮為臣藥，協同君藥加強活血祛痰作用;冰片為佐使藥，開竅醒神，清熱止痛，共奏化痰息風、祛瘀通絡、痰瘀同治、疏血通脈之功。現代藥理研究表明，所選藥物具有良好的改善腦循環、降血脂、抗氧化和細胞凋亡、保護神經等作用［9］。本研究提示，預先給予大鼠疏血通脈膠囊灌胃，能夠明顯減少大鼠腦缺血再灌注損傷后神經元凋亡的數量，改善神經功能，同時能夠顯著提高P-ERK的表達水平，提示疏血通脈膠囊預處理可能通過激活ERK信號通路誘導腦缺血耐受的發生，從而發揮腦保護作用。

本研究結果提示，ERK信號通路參與腦缺血耐受的形成，疏血通脈膠囊可能正是通過激活該信號通路起到誘導腦缺血耐受、發揮腦保護作用。這為藥物預處理誘導腦缺血耐受產生以及中醫“治未病”思想提供實驗基礎，同時也為“化痰祛瘀”法治療中風提供實驗依據。

［1］Blanco M， Lizasoain I， Sobrino T， et al. Ischemic preconditioning:a novel target for neuroprotective therapy［J］.Cerebrovase Dis，2006，21(Suppl2):38.

［2］劉泰，韋必清，韋玉進.醒腦通脈膠囊對腦缺血再灌注損傷神經細胞凋亡的影響［J］.遼寧中醫雜志，2005，32(2):89.

［3］劉泰，秦若飛，張青萍，等.醒腦通脈膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦后織IL-1β、IL-6和IL-8含量的影響［J］.廣西醫科大學學報，2008，25(1):1-4.

［4］劉泰，譚璐璐，秦若飛，等.醒腦通脈膠囊對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠TNF-a的影響［J］.廣西中醫學院學報，2008，10(4):13-16.

［5］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［6］Nicole O，Ali C，Docagne F，et al.Neuroprotection mediated by glial cell line-derived neurotrophic factor:Involvement of a reduction of NMDA-induced calcium influx by the mitogenactivated protein kinase pathway［J］.J Neursci，2001，21(9): 3024-3033.

［7］Choi JS，Kim HY，Cha JH，et al.Ischemic preconditioninginduced activation of ERK1/2 in the rat hippocampus［J］.Neurosci Letters，2006，409(3):187-191.

［8］梁妮，劉泰.醒腦通脈膠囊的中醫理論探源［J］.時珍國醫國藥，2008，19(7):1706.

［9］劉泰，張志偉.疏血通脈膠囊中醫理論探源［J］.時珍國醫國藥，2012，23(9):2295-2297.

Regulatory Research of Shuxuetong Capsule Preconditioning on Cerebral Ischemic Tolerance Induced by ERK Signaling Pathway

LIU Tai，HUANG De-Qing，ZHANG Yuan-Kan，HU Yue-Qiang，LIANG Ni，HU Yu-Ying，HE Qian-Chao，CHEN Rong-Qun，ZHANG Qing-Ping△
(The First Affiliated Hospital of Guangxi University of TCM，Nanning 530023，China)

Objective:To explore the function of ERK(extracellular-signal regulated kinas)signaling pathway in the induction of brain ischemic tolerance，and observe the function of Shuxue Tongmai capsule pretreatment.Methods:Ischemic preconditioning was performed for three minutes on the rats to induce the cerebral ischemic tolerance.Rat model of cerebral ischemia reperfusion(the ischemia pretreatment group，I/R group)was established 24 hours later.Western blot was used to detect the protein expression of ERK and P-ERK(phosphorylation extracellular-signal regulated kinas)，comparing the expression with the sham operation group，I/R group and Shuxue Tongmai capsule group and PD98059 group.TUNEl method was applied to detect the apoptosis of neurons and we also study the relationship between expression of ERK，P-ERK and the apoptosis of neurons.Results The expression of PERK in ischemia preconditioning group increased significantly and the apoptosis of neurons quantity declined.It was significantly to the I/R group.After given the PD98059，the ERK inhibitor，the expression level of P-ERK was restrain significantly and the apoptosis of neurons deteriorate significantly.Conclusion:Ischemia preconditioning can decrease the apoptosis of neurons in cerebral ischemia reperfusion，and improve neurologic function.Its mechanism related to the activation of the ERK signaling pathway.Shuxue Tongmai capsule pretreatment can protect the cerebral by the ERK signaling pathway.

Cerebral schemic preconditioning;Cerebral ischemia reperfusion;Shuxue Tongmai capsule;ERK signaling pathway

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0797-03

2015-03-10

廣西自然科學基金資助項目-疏血通脈膠囊預處理對腦缺血大鼠MAPKs通路的影響研究(2011GXNSFA018180);廣西攻關項目-缺血性中風新藥——疏血通脈膠囊的臨床前研究(桂科攻11107009-1-11)

劉 泰(1959-)，男，廣西桂林人，主任醫師，醫學學士，廣西名中醫，從事腦血管疾病的中西醫結合臨床與研究。

△通訊作者:張青萍(1969-)，男，河北人，副主任醫師，醫學碩士，從事腦血管疾病的中西醫結合臨床與研究，Tel:0771-5848502，E-mail:liutai590216@163.com。