MMP-2、MMP-9在口腔黏膜白斑中表達的研究*

蘇穎穎 杜啟濤 張茜 曲哲

白斑屬于癌前病變，已有報道其進展為鱗狀細胞癌與上皮異常增生的嚴重程度有直接的關系[1]，但目前還沒有一個明確的生物學指標來評估這一惡變[2]。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一種Zn2+依賴性的中性蛋白水解酶，可降解和塑造細胞外基質（extracellular matrix，ECM），維持細胞外基質的動態平衡，參與惡性腫瘤的發生及侵襲過程[3-4]。目前MMP在惡性腫瘤侵襲轉移方面的研究多有報道，而在白斑及上皮不同增生程度間表達的研究較少。本文應用免疫組織化學方法檢測MMP-2、MMP-9在正常口腔黏膜、白斑上皮單純性增生和異常增生中的表達情況，以期對兩者在白斑發生發展中的變化做初步的研究。

1 材料與方法

1.1 病例來源及選擇標準 本實驗選取的標本均為2008-2014年間大連市口腔醫院頜面外科的手術標本，所有患者均知情同意。其中正常組15例為黏液囊腫活檢標本中的正常口腔上皮組織。由2位高年資病理醫生重新復核切片將白斑分為兩組：白斑上皮單純增生組31例和白斑上皮異常增生組35例。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，取材后脫水制成石蠟，常規HE染色。實驗均設陽性對照和陰性對照，血管內皮細胞的陽性表達可作為內對照參考[2]。

1.2 臨床病理特征 白斑上皮單純性增生31例，其中男19例，女12例，白斑上皮異常增生35例，其中男18例，女17例，見表1。

表1 白斑上皮單純性增生和白斑上皮異常增生的發生部位

1.3 主要試劑及方法 兔抗人MMP-2多克隆抗體（即用型），兔抗人MMP-9單克隆抗體（1：100），均由北京中杉金橋公司購得。采用免疫組化SP染色法。

1.4 結果判定 MMP-2和MMP-9均以胞漿呈棕褐色為陽性。根據綜合染色強度和陽性細胞占總細胞數的百分比進行評價[5]：由兩人雙盲法觀察切片，染色陰性0分，染色弱1分，染色清晰2分，染色強3分；陽性細胞數<5%為1分，陽性細胞數5%~25%為2分，陽性細胞數26%~50%為3分，陽性細胞數>50%為4分。兩項之和≥4為陽性表達。

1.5 統計學處理 MMP-2和MMP-9的免疫組化結果和各自病理間的關系應用SPSS 12.0軟件進行 字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMP-2陽性表達在上皮細胞的胞漿中，主要分布于基底細胞層中，也可見棘細胞層中。三組陽性率表達情況見表2，三組比較差異無統計學意義（P>0.05）。此外，在上皮下結締組織中也發現了MMP-2的表達，以成纖維細胞表達居多，也可見炎細胞及血管內皮細胞中，成纖維細胞的陽性表達率見表3，三組比較差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 MMP-9陽性表達位于上皮細胞的胞漿中，多見于棘細胞層中。三組的陽性表達率見表4，其中白斑異常增生組較正常組和單純增生組比較差異有統計學意義（P<0.05）。在上皮下結締組織中也發現了MMP-9的陽性表達，以聚集在成纖維細胞、炎細胞、血管周圍表達居多。成纖維細胞的陽性表達見表5，其中異常增生組的陽性率較正常組及單純增生組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

表2 MMP-2在上皮內表達的免疫組化染色結果

表3 MMP-2在上皮下表達的免疫組化染色結果

表4 MMP-9上皮內免疫組化染色結果

表5 MMP-9上皮下免疫組化染色結果

3 討論

口腔癌的發病機理是一個多步驟、多因素的過程，其中包括從正常口腔黏膜到單純增生、異常增生、原位癌最后發展成浸潤癌的一個連續的病理過程[6]。白斑是口腔黏膜癌前病變中的一種，癌前病變是指轉變為鱗狀細胞癌的可能性增加的發生改變的上皮，這種上皮異常增生的程度越重，后期發展成癌的可能性就越大[7]。因此，有學者將無異常增生、可疑異常增生和輕度異常增生歸為低危險性；將中、重度異常增生和原位癌歸為高危險性[8]。

MMP-2、9是MMPs中重要的蛋白水解酶，主要降解Ⅳ型膠原蛋白。MMP-2基因位于人類染色體16q21，由12個內含子和13個外顯子組成，結構基因總長度為27 kb，分子量為72 KD，MMP-2可由體內多種細胞合成和分泌，包括成纖維細胞、內皮細胞、漿細胞、星形細胞、小膠質細胞、神經細胞、巨噬細胞、嗜酸粒細胞和中性粒細胞等[9]。MMP-9基因定位于20號染色體，分子量為92 KD，主要由角質形成細胞、中性粒細胞、單核細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞分泌[10-11]。MMP-2、9在正常組織表達較少，在腫瘤細胞中表達增加[12]，可降解細胞外基質，并與基底膜中IV型膠原的喪失有關，在細胞的浸潤和轉移中發揮重要的作用[13]。有研究顯示MMP-2、9可由EMMPRIN（細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子）調控，它可在腫瘤表面刺激鄰近成纖維細胞合成MMPs[14]。實驗結果顯示，上皮細胞與上皮下成纖維細胞均有MMP-2、9的陽性表達，從正常黏膜到異常增生，陽性表達率增加。這與以往研究結果相似[15-16]。推測，隨著上皮異常增生的程度增加，上皮內和上皮下的MMP分泌增加，共同作用于基底膜，使基底膜的連續性及完整性逐步降低，細胞的侵襲能力增加，形成惡性腫瘤的危險性增加。但本研究中MMP-2的陽性率在三組間無顯著差異可能與樣本量不足，或使用MMP-2多克隆抗體有關。MMP-9在上皮內和上皮下成纖維細胞中的陽性率在異常增生組中明顯高于正常組和單純增生組，且差異具有統計學意義（P<0.05），推測其參與了白斑的發生發展過程。但因白斑終究為基底層上皮內細胞學及結構的改變，且尚未突破基底膜，有實驗研究不論是MMP或是基底膜中的IV型膠原在白斑中僅有量變的過程，尚未達到質變，當發展成鱗癌時兩者才發生了較明顯的變化[13]。此外，本實驗數據顯示，正常口腔黏膜與單純增生組的陽性率差異不大，猜測單純增生可能僅僅是因為吸煙或摩擦引起的上皮增生，去除病因有可能減輕病變。進一步研究還需擴大樣本量，并增加對原位癌及鱗癌的觀察及基因學的檢測。

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