脂易消對NAFLD大鼠Visfatin蛋白表達的影響*

周岳君 陳玉翠

非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝臟損傷，其病理學改變與酒精性肝病（ALD）相似，但患者無過量飲酒史，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（Nonalcoholic simple fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis， NASH）、及相關肝硬化和肝細胞癌[1-4]。NAFLD是21世紀全球重要的公共健康問題之一，亦是我國愈來愈重視的慢性肝病，加強NAFLD的預防與治療，延緩和阻止NAFLD的發生、發展成為當前中西醫研究的熱點[5-6]。

NAFLD的發病機理至今尚未十分明確，近年有學者認為脂肪細胞因子在肝脂肪變性進程中可能起著十分重要的作用。其中內肥素（Visfatin）因具有類胰島素作用可降低血糖、參與脂肪代謝等生理環節而備受關注[7-8]。本實驗采用高脂飲食喂養制備NAFLD大鼠模型，通過中藥驗方脂易消予以干預，闡明Visfatin與NAFLD發病的相關性，探討NAFLD的發病機理和中醫藥治療NAFLD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠60只，雄性，體重（180±10）g，由中科院上海實驗動物中心提供，飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心，室溫23 ℃，濕度50%，明暗各12 h，隨機分籠喂養，自由飲水和采食，預養1周后進入實驗階段[9]。

1.2 藥物 脂易消：半夏、枳殼、荷葉、水飛薊、澤瀉、決明子等生藥材購自浙江省杭州市方回春堂國藥館[10]。易善復膠囊（多烯磷脂酰膽堿膠囊）：北京萬安特制藥有限公司，228 mg/粒，批號：D1141。使用前用蒸餾水超聲乳化，配制成1 L含多烯磷脂酰膽堿132.4 g。生理鹽水：浙江莎普愛思藥業有限公司，批號：110313-3。

1.3 器材 GKC可控硅恒溫水浴鍋，上海錦屏儀器儀表有限公司。3000紫外線分光光度儀，Pharmacin公司。TGL68高速臺式離心機，上海安寧科學儀器廠。OLIMPUS顯微鏡，日本OLYMPUS公司。7170全自動生化分析儀，日本AAS公司。Hoefer300電轉 儀；IS1000凝 膠 成 像 儀；MyCycler PCR儀；The BioRadiCyclerIq PCR儀；Optical Caps （8 Caps/Strip）（Applied Biosystems； Cat # 4323032）；Optical Adhesive Covers （Applied Biosystems； Cat # 4311971，美國BioRad公司。WD900TL23-2微波爐，Galanz。ZF-90型暗箱式紫外透射儀，上海顧村電光儀器廠。DYY-6B型穩壓穩流電泳儀，北京市六一儀器廠。DNA離心干燥箱，上海安亭科學儀器廠。Ultrospec3300pro微量核酸測量儀，Ampersand。冷凍臺式高速離心機，Heraeus。可調微量加樣槍，Thermo Labsystems。-80 ℃低溫冰箱，Sanyo。AR2130電子精密天平OhausCorp.Pine Brook，NJ，USA。YDS-3S液氮生物容器，四川亞西機器廠[11-12]。

1.4 試劑 TG檢驗試劑盒，上海申能-德賽有限公司，批號：571/017/01；TC檢驗試劑盒，上海申能-德賽有限公司，批號：130/016/01；氯仿（分析純）浙江迪耳藥業有限公司。異丙醇（分析純），浙江杭州雙林化工試劑廠。瓊脂糖（agarose）溴化乙錠（EB），上海生工生物工程技術服務有限公司。M-MLV RTase，invitrogen。Taq 酶，Oligod（T）18Primers，RNase inhibitor，dNTP，100 bp marker等。

1.5 方法

1.5.1 造模與分組 將60只雄性SD大鼠隨機分成脂易消低、中、高劑量治療組，易善復陽性對照組，模型對照組和正常對照組6組，每組各10只。正常組予普通飼料喂養，其余予高脂飼料喂養（內含10%豬油、2%膽固醇、0.5%膽鹽、5%蛋黃粉，82.5%普通飼料）喂養，造模12周后處死動物。

1.5.2 給藥途徑及劑量 脂易消低、中、高劑量治療組干預劑量分別相當于成人每千克體重臨床用量的3、6、12倍，易善復劑量相當于成人每千克體重臨床用量的6倍，均為臨床等效劑量。實驗劑量按照實驗動物研究“等效劑量”的計算方法（50 kg人/200 g大鼠的轉換系數r=0.021）計算等效脂易消劑量[13]。實驗劑量經計算確定如下：低劑量組，高脂飼料喂養，按等效劑量7.5 g/（kg·d）灌胃，共12周；中劑量組，高脂飼料喂養，按等效劑量15 g/（kg·d）灌胃，共12周；高劑量組，高脂飼料喂養，按等效劑量30 g/（kg·d）灌胃，共12周；易善復組，高脂飼料喂養，按等效劑量69.2 mg/（kg·d）灌胃，共12周；正常組，標準飼料喂養，等容量的生理鹽水灌胃，1次/d，共12周；模型組，高脂飼料喂養，等容量的生理鹽水灌胃，1次/d，共12周。

1.5.3 標本采集與保存 實驗大鼠飼養至第12周末次給藥后，當晚禁食12 h但不禁水，次日上午用10%水合氯醛溶液（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，心臟取血，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存待用；迅速取出肝組織，稱重，在肝右葉中部切取數塊肝組織保存于液氮中以備用。

1.5.4 指標檢測

1.5.4.1 肝組織勻漿TC、TG變化檢測 將玻璃試管中新鮮肝組織稱重，精密稱定，剪碎后加入9倍冰生理鹽水，用均質機磨成10%肝組織勻漿后，4000 r/min離心10 min，提取上清液，上清液即為肝組織勻漿制品。肝勻漿TC、TG測定均按試劑盒說明操作。

1.5.4.2 肝組織病理學檢測 取大鼠肝臟右葉肝組織，HE染色觀察肝組織炎癥、細胞變性情況等一般病理改變。非酒精性脂肪性肝炎病理學診斷標準參考《非酒精性脂肪性肝炎診斷指南》實施[1]。（1）依據肝細胞脂肪變性占據所獲取肝組織標本量的范圍，分為5度（F0~4）：F0：肝細胞內無脂滴沉積；F1：肝小葉內<30%的肝細胞有脂肪變；F2：肝小葉內30%~50%的肝細胞有脂肪變；F3：肝小葉內50%~75%的肝細胞有脂肪變；F4：75%以上的肝細胞有脂肪變。（2）依據炎癥程度分為4級，G0：無炎癥；G1：腺泡3帶呈現少數氣球樣肝細胞，腺泡內散在個別點灶狀壞死；G2：腺泡3帶明顯氣球樣肝細胞，腺泡內點灶狀壞死增多，門管區輕-中度炎癥；G3：腺泡3帶廣泛的氣球樣肝細胞，腺泡內點灶狀壞死明顯，門管區輕-中度炎癥或門管區周圍炎癥。

1.5.4.3 ELISA法檢測Visfatin蛋白表達 按照試劑盒操作說明進行，通過繪制標準曲線求出肝組織標本中Visfatin蛋白濃度。

1.6 統計學處理 使用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用單因素方差分析（one way ANOVA），以P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

在實驗期間，共有2只大鼠死亡，其中低劑量組1只，高劑量組1只。正常組大鼠精力旺盛，活潑好動，飲食正常，毛發有光澤，糞便成形，體重增加緩慢。模型組大鼠體重較正常組增長較快，毛發油膩，糞便松軟粘臭，不成形，實驗初期活動尚可，后期大鼠活動減少，形體肥胖，動作慵懶。脂易消高劑量組、中劑量組、低劑量組及易善復組大鼠體重增加緩慢，狀態較模型組好，但不及正常組。

2.1 肝勻漿生化指標的測定 與正常組相比，脂易消各劑量組、易善復組、模型組大鼠肝組織TC含量顯著增加，差異均有統計學意義（P<0.01）；與模型組相比，脂易消各劑量組和易善復組TC水平均有顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）；與易善復組相比，脂易消各劑量組肝組織TC水平差異均無統計學意義（P>0.05）。大鼠肝組織勻漿TG水平：與正常組相比，脂易消各劑量組、易善復組TG水平差異均無統計學意義（P>0.05），模型組大鼠肝組織TG含量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組相比，脂易消各劑量組和易善復組TG水平顯著降低，差異均有統計學意義（P>0.05）；與易善復組相比，脂易消各劑量組肝組織TG水平差異均無統計學意義（P>0.05），見表 1。

表1 各組大鼠肝勻漿TC、TG變化（x-±s）

2.2 常規HE染色光鏡下觀察

2.2.1 正常組 HE染色顯示，大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞多為單核，肝板呈條索狀，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無脂肪變性及炎癥細胞浸潤，見圖1。

2.2.2 模型組 HE染色顯示，大鼠肝組織可見彌漫性肝細胞脂肪變，細胞腫脹，胞漿疏松，存在大量脂肪空泡。匯管區和小葉間有炎癥細胞浸潤，正常的肝小葉結構被破壞，部分大鼠小葉內壞死灶融合成片，但未見肝纖維化形成，其肝組織脂肪變性程度與正常組比較差異有統計學意義（P<0.01），見圖 2、表 2。

2.2.3 脂易消各劑量組 HE染色顯示，大鼠肝組織呈彌漫性肝細胞脂肪變，可見小泡性、大泡性及氣球樣混合的脂肪變性，程度較模型組略輕，但差異無統計學意義（P>0.05）。匯管區和小葉間有少量炎癥細胞浸潤，其炎癥積分明顯低于模型組，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01），見圖3~5、表2~3。

2.2.4 易善復組 基本與脂易消各劑量治療組相近，大鼠肝組織可見彌漫性、混合性肝細胞脂肪變，匯管區有炎癥細胞浸潤，有少量點灶狀壞死。其炎癥積分與脂易消各劑量組比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖6、表2~3。

圖1 正常大鼠（HE染色×280）

圖2 模型組大鼠 （HE染色×100）

圖3 脂易消低劑量組大鼠（HE染色×100）

圖4 脂易消中劑量組大鼠 （HE染色×100）

圖5 脂易消高劑量組大鼠（HE染色×100）

圖6 易善復組大鼠 （HE染色×100）

表2 各組大鼠肝脂肪變性程度 只

表3 各組大鼠肝組織炎癥活動度 只

2.3 肝組織Visfatin蛋白表達水平檢測 大鼠肝組織Visfatin蛋白表達情況：低劑量組為（17.31±0.27）ng/L，中 劑 量 組 為（16.85±0.44）ng/L， 高 劑 量 組 為（16.97±0.58）ng/L，易善復組為（17.19±0.38）ng/L、模型組為（18.52±1.38）ng/L，正常組為（16.02±15）ng/L。與正常組相比，模型組、脂易消低劑量組大鼠肝組織Visfatin蛋白表達明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；與模型組相比，脂易消各劑量組及易善復組大鼠肝組織Visfatin蛋白表達均明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；與易善復組相比，脂易消各組大鼠肝組織Visfatin蛋白表達差異均無統計學意義（P>0.05）。大鼠內脂素濃度測定標準曲線見圖7。

圖7 大鼠內脂素濃度測定標準曲線

3 討論

本實驗結果表明，模型組大鼠肝組織內TG、TC含量均顯著上升，而脂易消各劑量組大鼠肝組織TC、TG含量均較之降低，表明脂易消能抑制肝臟細胞內TC、TG合成，從而改善NAFLD的進展。

脂易消能抑制肝臟細胞內TC、TG合成，改善NAFLD的發病進展，能改善肝細胞炎癥活動度，減輕肝組織損傷，顯著降低NAFLD大鼠肝組織Visfatin蛋白表達水平，本實驗提示脂易消治療NAFLD療效確切，其作用機理可能與Visfatin參與了NAFLD的發生、發展有關。脂易消可能通過影響Visfatin的合成和分泌從而改善了NAFLD的生化指標。已有實驗證明Visfatin具有類胰島素作用并可以降低血糖、參與脂質代謝及炎癥反應，因此進一步深入研究Visfatin是通過胰島素信號通路還是其他信號通路參與了NAFLD的發生和發展具有積極的意義[14-15]。

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