手術切口局部浸潤羅哌卡因復合地佐辛超前鎮痛對GM-CSF表達及切口愈合的影響

喬芬 程橋 凡浙錄

手術切口的疼痛處理日益引起廣泛關注[1-2]。為了術后更充分的鎮痛，專家學者們根據術后疼痛的機制提出了多模式鎮痛的方法。而切口部位的局部浸潤麻醉是術后鎮痛的常用方法，超前鎮痛的理念也廣泛應用于臨床麻醉過程中。有研究證明，0.5%羅哌卡因局部浸潤麻醉促進GM-CSF表達，利于傷口愈合[3-4]。而地佐辛作為一種阿片受體混合激動拮抗劑，鎮痛效果強而不良反應少，用于臨床麻醉即術前或術后鎮痛[5-8]。但其對GM-CSF表達及傷口愈合的影響尚不明確。本實驗擬研究地佐辛及兩種藥物復合使用對GM-CSF表達及傷口愈合的影響，為臨床用藥提供新的思路，現具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔雄性昆明小鼠100只（由山西省腫瘤醫院動物房提供），體重25~30 g，采用隨機數字表法將小鼠分為生理鹽水浸潤組（NS組）、0.5%羅哌卡因局部浸潤組（L組）、地佐辛術前腹腔注射組（D組）、0.5%羅哌卡因局部浸潤復合地佐辛術前腹腔注射組（Y組），每組25只。將小鼠單籠飼養，每籠編號，依次為1~100號。

1.2 方法

1.2.1 切口痛模型制備 將小鼠腹腔注射6%戊巴比妥鈉（0.01 mL/g）麻醉，俯臥位固定于具有保溫設施的實驗臺，背部脫毛消毒，于背部近頸側以脊柱為中線切除約0.8 cm×0.8 cm大小（約占體表面積的1.2%，由Meech-Rub-ner公式計算）皮膚全層切口。L組、D組、Y組分別于切皮前10 min皮下注射羅哌卡因（海南斯達制藥有限公司）1 mL/kg，腹腔注射地佐辛（揚子江藥業集團有限公司）5 mg/kg，皮下注射羅哌卡因1 mL/kg、腹腔注射地佐辛5 mg/kg。L組、D組、NS組不注射藥物部分注射等劑量生理鹽水。

1.2.2 創面愈合率及GM-CSF濃度測定 于傷后72 h在不同處理組中按完全隨機原則分別選取20只小鼠，行頸椎脫位術將小鼠處死，處死后取小鼠組織前用相機拍攝創面，所得圖像用Photoshop軟件進行創面大小計算，以便測定傷后各組創面愈合率。照相后取材，切取包括4 mm的正常創緣的創面組織，超聲波粉碎后，制成組織勻漿，將制備好的勻漿離心留上清液，采用雙抗體一步夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測GM-CSF濃度（試劑盒購于北京四正柏生物科技有限公司），同時用BCA法測上清液蛋白濃度（試劑盒購于北京普利萊基因技術有限公司），為減小取材誤差，以二者之比表示GM-CSF濃度進行比較，具體操作如下。

1.2.2.1 ELISA操作方法 （1）標準品液配制：使用前加入蒸餾水混勻，配成200 ng/mL的溶液。設標準管8管，第1管加標本稀釋液900 μL，第2~8管加入標本稀釋液500 μL，在第1管中加入200 ng/mL的標準品溶液100 μL混勻后用加樣器吸出500 μL，移至第2管。如此反復做對倍稀釋，從第7管中吸出500 μL棄去。第八管為空白對照。（2）10×標本稀釋液用蒸餾水做1∶10倍稀釋。（3）洗滌液：用重蒸水1∶20稀釋。（4）加樣：設空白孔1個，標準孔7個，待測樣品54個。每孔各加入標準品或待測樣品100 μL，將反應板充分混勻后置37 ℃ 120 min。（5）洗板：用稀釋后洗滌液將反應板充分洗滌4次，向濾紙上印干。（6）每孔中加入第一抗體工作液100 μL。將反應板充分混勻后置37 ℃ 60 min。（7）洗板：再用稀釋后洗滌液將反應板充分洗滌4次，向濾紙上印干。（8）每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應15 min。（9）每孔加入100 μL終止液混勻。（10）30 min內用酶標儀在450 nm處測OD值。

1.2.2.2 ELISA測定結果的計算與判斷 （1）所有OD值都應該減除空白值后再進行計算。（2）以標準品20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0 ng/mL 為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。根據標準品及對應的OD值計算出標準曲線的回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.2.2.3 BCA法 （1）取0.8 mL蛋白標準配置液加入到一管蛋白標準（20 mg BSA）中，充分溶解后配置成25 mg/mL的蛋白標準溶液。（2）取適量25 mg/mL蛋白標準溶液，稀釋至終濃度為0.5 mg/mL。（3）根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50∶1）配制適量BCA工作液，充分搖勻。（4）將標準品按 0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到 96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20 μL。（5）加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標準品稀釋液到20 μL。（6）各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min。（7）測定A562，540~595 nm之間的波長也可接受。根據標準曲線計算出樣品的標準濃度。

1.3 觀察指標 （1）創面愈合時間：每組未處死5只小鼠，記錄創面達到完全愈合所需時間；（2）創面愈合率：創面愈合率=[（創面原有面積-各時相點創面測得面積）/創面原有面積]×100%；（3）GM-CSF表達：用ELISA法測得的GM-CSF濃度與BCA法測得的上清液蛋白濃度之比表示GM-CSF濃度。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件處理數據，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組小鼠創面愈合率及GM-CSF濃度比較 L、D、Y組切口愈合率、GM-CSF濃度均高于NS組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。D組切口愈合率、GMCSF濃度與L組比較差異無統計學意義（P>0.05）；Y組切口愈合率及GM-CSF濃度均高于L組且高于D組，比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 四組小鼠創面愈合率及GM-CSF濃度比較（x-±s）%

2.2 四組小鼠切口愈合時間比較 NS、L、D、Y組的切口愈合時間分別為（17.8±1.30）、（12.0±1.23）、（11.6±0.89）、（9.8±0.87）d，L、D、Y 組切口愈合時間均較NS組短，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。D組切口愈合時間與L組比較差異無統計學意義（P>0.05）；Y組切口愈合時間短于D組及L組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

臨床上羅哌卡因局部浸潤和地佐辛靜脈注射均可產生良好的鎮痛作用，且有實驗證明0.5%羅哌卡因局部浸潤麻醉有促進傷口愈合的作用，而地佐辛對傷口愈合的影響不明確。GM-CSF是細胞中的粒細胞和巨噬細胞譜系的成熟和功能的重要調節劑，其參與了皮膚組織的創傷愈合，小鼠切口痛后72 h皮膚組織GM-CSF表達增加達峰值[9-11]。因此本研究選擇0.5%羅哌卡因和地佐辛進行麻醉鎮痛，術后72 h測定GMCSF濃度。

本研究結果表明，0.5%羅哌卡因術前局部浸潤麻醉有促進GM-CSF表達的作用，地佐辛超前鎮痛也有促進GM-CSF表達的作用且二者復合使用促進GMCSF表達的作用更佳，但0.5%羅哌卡因與地佐辛二者促進GM-CSF表達比較差異無統計學意義（P>0.05）。GM-CSF對傷口愈合的4個時相（止血、炎癥反應、增殖和組織重塑）都有促進的作用[6]。（1）止血階段：血管收縮，凝血級聯反應的啟動及所形成的止血栓共同起到了止血作用。已有報道從GM-CSF的注射部位打孔活檢組織觀察到GM-CSF注射部位的止血速度要比其他部位快。（2）炎癥反應階段：吞噬細胞需要清除存在于創面的壞死的物質，細胞的碎片和各種有害微生物。GM-CSF借以通過對中性粒細胞和巨噬細胞的增殖和活化能力的促進作用，來提高其吞噬活性還有其殺菌的能力，同時GM-CSF也可以刺激巨噬細胞分泌有利于創面愈合的一些細胞因子，如PDGF、FGF、TGF、EGF、VEGF等。（3）增殖階段：膠原基質形成、肉芽組織形成及角質上皮增殖，爬行覆蓋創傷表面及進一步分化。GM-CSF可刺激增加成纖維細胞中α-肌動蛋白的產生，而后者是肉芽組織形成所必需的。GM-CSF同時刺激新生角質化上皮的增殖反應。且在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子注射部位的表皮蛋白、角蛋白等物質產生均有所增加，而且這些蛋白的表達增加，正好是角質化上皮細胞迅速分化的結果。（4）組織重塑階段：傷口收縮，膠原纖維有序重排和創口上皮的抗張力強度增加。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子不但可以使傷口的收縮增加，也可增強傷口周圍組織的抗張力強度。研究證明，治療用rhGM-CSF影響了潰瘍性黏膜組織炎性細胞因子，降低了口腔黏膜潰瘍，也對深Ⅱ度燒傷的傷口清創愈合有促進作用[9，12]。rhGM-CSF凝膠可促進糖尿病大鼠創面愈合，引起皮膚組織中微小RNA明顯差異性表達，這可能是其促進創面愈合在基因轉錄后水平上的靶點，且對糖尿病傷口經促炎因子水平的上調及新毛細血管的生成，從而促進傷口愈合[13-14]。同時，GMCSF的應用可以減少膠原蛋白的沉積，減少瘢痕的形成且可對傷口重塑和促進聲帶再生[15-16]。本實驗的研究結果表明，與生理鹽水組比較，其他三組小鼠傷口痛模型72 h后，GM-CSF均增加，且傷口愈合時間縮短，傷口愈合率提高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。推測為0.5%羅哌卡因局部浸潤麻醉和地佐辛靜脈注射可以促進GM-CSF的表達，進而促進傷口愈合。

綜上所述，0.5%羅哌卡因術前局部浸潤麻醉能促進GM-CSF表達，進而促進傷口愈合，地佐辛超前鎮痛也能使GM-CSF表達增加并促進傷口的愈合且兩者復合使用對GM-CSF表達及傷口愈合作用更佳。但0.5%羅哌卡因與地佐辛促進傷口愈合及GM-CSF表達的效果比較差異無統計學意義（P>0.05）。

[1]姜濤.舒適麻醉在剖宮產手術中的運用與效果評價[J].中國醫學創新，2014，11（1）：71-73.

[2]昝小剛，杜增利.術前鞘內注射不同劑量嗎啡聯合芬太尼對子宮切除術后鎮痛的療效分析[J].中國醫學創新，2014，11（11）：52-54.

[3]王文璽，程橋，凡浙錄，等.局麻藥物對粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子表達及皮膚愈合的影響[J].中國藥物與臨床，2014，14（6）：756-758.

[4]商曉磊，孟葉.不同濃度羅哌卡因浸潤麻醉對大鼠切口愈合的影響[J].中華麻醉學雜志，2012，32（12）：1453-1456.

[5]劉春陽.地佐辛對脊柱手術后舒芬太尼靜脈鎮痛效果的影響[J].中國醫學創新，2014，11（19）：44-46.

[6]王海龍，于丹.地佐辛復合丙泊酚聯合局部麻醉在輸卵管結扎術中的應用[J].中國醫學創新，2014，11（27）：48-50.

[7]楊晴，馬傳根，張義軒，等.地佐辛聯合舒芬太尼應用于乳腺癌術后靜脈自控鎮痛的臨床觀察[J].中國醫學創新，2014，11（30）：36-38.

[8]劉鳳梅，魏桂良，米志華，等.地佐辛超前鎮痛對腹腔鏡膽囊切除術后鎮痛效果的影響[J].實用臨床醫藥雜志，2012，16（5）：80-81.

[9] Won J H.Effect of rice cell-derived human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on 5-fluorouracil-induced mucositis in hamsters[J].Biological & Pharmaceutical Bulletin，2013，36（3）：425-431.

[10]劉繼松，方勇，姚敏，等.重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子對燙傷大鼠創面愈合及新生血管化的影響[J].蚌埠醫學院學報，2012，37（1）：17-18.

[11]郭敏，崔文慧，徐祥，等.小鼠急性皮膚缺損創面粒-巨噬細胞集落刺激因子表達特點及其作用機制[J].中華創傷雜志，2011，27（7）：648-649.

[12] Liu L S.Effect of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on wound debridement and healing of deepⅡ thickness burn[J].Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery，2011，25（9）：1059-1062.

[13]劉移峰，劉德伍，郭光華，等.重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子對糖尿病大鼠創面愈合及微小RNA表達的影響[J].中華燒傷雜志，2014，30（3）：243-250.

[14] Fang Y，Shen J，Yao M.Granulocyte-macrophage colonystimulating factor enhances wound healing in diabetes via upregulation of proinflammatory cytokines[J].British Journal of Dermatology，2010，162（3）：478-486.

[15] Jorgensen L N，Agren M S，Madsen S M，et al.Dose-dependent impairment of collagen deposition by topical granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in human experimental wounds[J].Jorgensen Annals of Surgery，2002，236（5）：684-692.

[16] Lim J Y，Choi B H，Lee S，et al.Regulation of wound healing by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor after vocal fold injury[J].Plos One，2013，8（1）：e54 256.