凝血酶抑制劑nexin-1對大鼠腦出血后腦水腫的保護作用機制的研究

陳洪芹

腦出血在臨床中有較高的死亡率和致殘率，研究表明腦出血后會并發有嚴重的炎癥反應、腦細胞毒性損傷、腦水腫等，其中腦水腫是腦出血最為常見和最為嚴重的并發癥[1]。研究證實腦出血后大量產生的凝血酶會對大腦產生毒性作用并會引起腦組織產生嚴重的水腫[2]。Caspase-3是機體中特異性的死亡信號轉導分子，在細胞凋亡的過程中起到非常重要的作用[3]。有研究表明血腦屏障通透性的異常增加與血腦屏障中的緊密連接復合體的異常變化有關，而Claudin-5和ZO-1是緊密連接復合體重要的組成部分[4-5]。凝血酶抑制劑nexin-1是一種內生的絲氨酸蛋白水解酶，能迅速的抑制凝血酶的表達及活性[6]。本課題組的前期研究已經證實凝血酶抑制劑nexin-1對大鼠腦出血后腦水腫有保護作用，但對于凝血酶抑制劑nexin-1對大鼠腦出血后腦水腫的保護作用的機制還未清楚。因此本文通過檢測nexin-1干預腦出血大鼠后相關活性因子水平，來探討nexin-1保護大鼠腦出血后腦水腫的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取有清潔級的Wistar大鼠90只，雄性，體重200~250 g，實驗動物由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供，實驗大鼠合格證號為SCXK（黑）：2013-002。

1.2 主要試劑及儀器 試劑：凝血酶抑制劑nexin-1（Gibco公司），水合氯醛（山東齊魯制藥廠），伊文思藍（Bioworlde公司），凝血酶受體兔抗鼠多克隆抗體、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體、Claudin-5兔抗鼠多克隆抗體、ZO-1兔抗鼠多克隆抗體（Bioworlde公司），凝血酶ELISA檢測試劑盒。儀器：立體定位儀（Amersham Biosciences公司），分析天平（上海精密科學儀器有限公司），分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），電泳儀（Bio-Rad公司），低溫離心機（EPPENDORF公司）。

1.3 動物分組、模型復制及給藥 本研究共分為對照組、模型組和干預組，每組大鼠均為30只，每組又根據動物處理時間再分為12、24 h和36 h組，每組每個時間段處理10只。本研究中的模型組和干預組對動物模型復制采用大鼠自體動脈血注射的方法復制腦出血大鼠模型。主要步驟為：將購買的符合體重要求的大鼠適應性喂養1周，用3.5%的水合氯醛腹腔注射的方式麻醉大鼠，將麻醉后的大鼠置于立體定位儀中，在大鼠頭皮正中行切口，左側顱骨鉆孔（中線旁開3 mm，前囟前0.2 mm）。用注射器取尾動脈自體血（50 μL），不加抗凝劑。注射器迅速連上針頭，將動脈血迅速的注入顱骨下5.5 mm的左側尾狀核。然后換另一側，盡量減少反流。然后緩慢移出。用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮。對于對照組大鼠步驟與上述基本一致，只是在尾狀核部位注入的是50 μL生理鹽水。在對照組和模型組大鼠復制模型的同時往大鼠的尾狀核部位注入10 μL的生理鹽水，在干預組大鼠復制模型的同時往大鼠的尾狀核部注入10 μL的凝血酶抑制劑nexin-1。

1.4 指標檢測 各組大鼠在模型復制成功并給藥12、24 h和36 h后腹腔注射3.5%的水合氯醛麻醉后迅速斷頭取出腦組織，其后操作如下。

1.4.1 腦組織中凝血酶受體PAR-1表達水平檢測 采用免疫組化法檢測各組大鼠腦組織中PAR-1受體的表達情況。將出血側有針孔的大腦表面冠狀切開，取前部腦出血周圍厚度為3 mm的腦組織標本，用10%甲醛固定、脫水、包埋，用石蠟切片機對包埋后的腦組織標本進行切片，切片厚度為5 μm，對切再進行脫蠟至水，熱修復，過氧化氫封閉內源性過氧化氫酶，滴加PAR-1兔抗鼠多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，沖洗，滴加二抗，沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，PBS返藍，脫水后封片，顯微鏡下觀察并計算吸光度。

1.4.2 腦組織中Caspase-3、Claudin-5和ZO-1表達水平檢測 采用Western Blotting法檢測各組大鼠腦組織中Claudin-5和ZO-1表達水平。在冰浴上迅速分離注射部位及周圍腦組織，加入適量的裂解液在低溫的條件下使用玻璃勻漿器對腦組織進行勻漿，在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心5 min，吸取上清液，加入適量的上樣緩沖液水煮后用凝膠電泳儀對總蛋白進行分離，將目的蛋白轉至NC醋酸纖維素膜上，在5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h，3次洗膜，加入Caspase-3、Claudin-5和ZO-1兔抗鼠多克隆抗體在4 ℃的條件性孵育過夜，3次漂洗，在辣根過氧化物酶標記的二抗中常溫下孵育2 h，3次洗膜，涂抹ECL發光試劑，暗室內曝光、拍照，分析目的蛋白和內參蛋白的灰度值并進行統計。

1.5 統計學處理 本研究中所收集到的數據采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學處理，計量資料以（±s）表示，組間數據比較采用方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組PAR-1蛋白表達水平比較 模型組PAR-1的陽性表達水平高于對照組及干預組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；且模型組在造模成功后12 h表達程度最高，隨著nexin-1干預時間的延長PAR-1的陽性表達程度呈下降趨勢，見表1及圖1。

表1 各組PAR-1蛋白表達水平比較（x-±s）

圖1 各組大鼠腦組織中PAR-1蛋白表達水平（SP×400）注：A：對照組12 h；B：模型組12 h；C：模型組24 h；D：模型組36 h；E：干預組12 h；F：干預組24 h；G：干預組36 h

2.2 各組Caspase-3表達水平比較 模型組Caspase-3的陽性表達水平高于對照組及干預組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；且模型組在造模成功后12 h表達程度最高，隨著nexin-1干預時間的延長Caspase-3的陽性表達程度呈下降趨勢，見表2。

表2 各組Caspase-3蛋白表達水平比較（x-±s）

2.3 各組Claudin-5表達水平比較 模型組Claudin-5蛋白表達水平低于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05），并且模型組Claudin-5蛋白在造模成功后12 h的表達程度最低；干預組Claudin-5蛋白的表達程度高于模型組，比較差異有統計學意義（P<0.05），并且隨著nexin-1干預時間的延長Claudin-5蛋白的表達程度呈上升趨勢，見表3。

表3 各組Calaudin-5蛋白表達水平比較（x-±s）

2.4 各組ZO-1表達水平比較 模型組ZO-1蛋白表達水平低于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05），并且模型組ZO-1蛋白在造模成功后12 h的表達程度最低；干預組ZO-1蛋白的表達程度高于模型組，比較差異有統計學意義（P<0.05），并且隨著nexin-1干預時間的延長ZO-1蛋白的表達程度呈上升趨勢，見表4。

表4 各組ZO-1蛋白表達水平比較（x-±s）

3 討論

腦出血是臨床中常見的一種腦部疾病，在臨床中有較高的死亡率和致殘率。研究表明發病30 d內腦出血的死亡率高達50%左右，未死亡的腦出血患者在6個月內僅有20%左右的患者能有功能意義上的恢復[7]。因此尋找有效治療腦出血的內科治療方法急為迫切。腦出血后會發生嚴重的腦水腫，腦水腫會致使腦神經細胞產生不可逆的凋亡[8]。已經有研究表明腦出血后產生的血腫塊可以誘發產生大量的凝血酶。凝血酶在正常人群的大腦中很難被檢測出來，但是在腦出血患者的機體中會被檢測出來[9]。小劑量的凝血酶可以保護腦出血的腦組織[10-11]。這主要是因為三點：（1）小劑量的凝血酶可以保護腦神經細胞和腦星形細胞，避免其因為微環境的缺血、缺氧、低血糖而死亡；（2）小劑量的凝血酶可以促進腦膠質細胞合成和分泌神經生長因子，進而促進腦神經細胞的軸突生長；（3）小劑量的凝血酶可以降低出血范圍的增加，減輕腦水腫。而大劑量的凝血酶在腦出血有嚴重的毒性，大劑量的凝血酶會促進腦出血后腦神經細胞損傷、腦血腫、炎癥、腦神經細胞凋亡等[12]。動物實驗的研究結果已經表明腦出血后并發的腦水腫主要是由于大量的凝血酶產生的毒性作用所引起的[13]。因此抗凝血酶成為目前治療腦出血及其并發癥的一個非常重要的新型的治療方向。本課題組的前期已經研究證實凝血酶抑制劑nexin-1對腦出血大鼠有很好的保護作用，可以改善腦出血后腦組織的病理損傷，減緩腦出血后腦組織神經細胞凋亡程度，降低腦出血后血腦屏障通透性和腦組織含水量。

大劑量的凝血酶在腦出血后腦組織神經細胞凋亡和腦水腫的過程中起重要的作用，主要是由于凝血酶有凝血酶受體介導諸多的活性物質而引起一系列的生化反應而產生的[14]。凝血酶受體（PAR）是一種蛋白激酶受體，研究發現PAR主要有4種亞型，分別為PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4，其中PAR-2主要是受胰蛋白酶以及凝血因子Ⅶ和Ⅹ激活，而PAR-1、PAR-3和PAR-4是受到凝血酶激活[15]。本研究中受凝血酶抑制劑nexin-1干預的腦出血大鼠腦組織中的PAR-1的表達較模型組顯著性降低，比較差異有統計學意義（P<0.05），這說明nexin-1對腦出血大鼠的保護作用可能是與抑制PAR-1的表達有關。

綜上所述，凝血酶抑制劑nexin-1對腦出血大鼠的腦組織神經細胞和血腦屏障通透性具有保護作用，可能是通過降低腦組織中的PAR-1、Caspase-3的表達以及升高腦組織中的Claudin-5和ZO-1的表達而起作用。

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