FQ-PCR檢測BALF中結核桿菌-DNA對肺結核診斷的應用研究

童建林 饒常紅 黃渤

本文通過FQ-PCR檢測BALF（Bronchoalveolar lavage fluid）中結核桿菌-DNA對肺結核的診斷進行分析研究，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2013年12月-2014年11月期間本院收治的肺結核患者110例作為本次研究的對象，其中男67例，女43例，年齡17~68歲，平均（43.5±2.2）歲。所有患者臨床診斷表現為胸片或胸部CT檢查顯示肺部有病變，肺部單側或雙側有斑塊狀或片狀陰影、結節等[1-2]。所有患者自愿參與本次研究，且簽訂了知情同意書。

1.2 方法 所有患者均實施纖支鏡檢查、活檢、刷檢，BALF中結核桿菌-DNA等檢查，且在這些檢查之前，對患者實施血常規、血凝四項等檢查[3]。檢查中使用到的設備、儀器主要有：纖支鏡型號為PENTAX，PCR擴增儀由美國PE公司提供；熒光檢測儀（DA7600）、DNA提取液、TaG-DNA酶、熒光標記引物、定量標準品（TB-DNA濃度：106基因拷貝/μL）由中山醫科大學達安基因診斷中心提供。檢查步驟如下：（1）支氣管鏡檢查：按照支氣管鏡儀器使用說明書，進行相關的操作檢查，并讓患者做好相關的檢查前準備，參照患者的X線檢查、CT檢查結果，在支氣管鏡下對患者的肺部進行觀察，如果有可以進行活檢的病灶，則使用活檢鉗在病灶上取下3~5塊的組織，使用10%福爾馬林固定后進行病理檢驗。一次性細胞刷對病變部位進行涂片、抗酸染色、細胞學檢查，生理鹽水支氣管灌洗，收集灌洗液，進行BALF結核桿菌DNA檢查[4-5]。如果在支氣管鏡下沒有發現可以進行活檢的病灶，需要根據患者的病變位置，刷檢后再進行灌洗。（2）BALF結核桿菌DNA檢查處理：取灌洗液1~1.5 mL，在轉速為12 000 r/min的離心機中離心5 min；取沉淀物，加入無菌生理鹽水1 mL，振蕩混勻，然后在轉速12 000 r/min的離心機中離心5 min；取沉淀物，加入50 mL DNA提取液混勻，在100 ℃恒溫下處理10 min；然后在4 ℃冰箱中冷卻至室溫后，再進行12 000 r/min離心5 min，取上清液2μL加入PCR反應管，8000 r/min離心數秒，然后將反應管取出放入PCR儀，在PCR反應后行熒光FQ-PCR檢測，記錄讀數。取灌洗液5 mL，離心、沉淀、涂片，進行細胞學檢查。支氣管鏡無菌鹽水沖洗后，取沖洗液于無菌瓶中，進行熒光定量檢查。本次研究中，所有的實驗室檢查步驟中，使用到的試劑均為相應的檢查儀器配套試劑，儀器的操作需要嚴格的按照操作說明書進行。

1.3 觀察指標 針對本次研究中各種檢查方法下的結核桿菌-DNA陽性率進行觀察分析。

1.4 統計學處理 使用統計學軟件SPSS 15.0進行處理分析，計量資料采用（±s）表示，計數資料采用 字2檢驗、Wilcoxon檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光FQ-PCR檢測與金標準結果比較 本次研究中確診為肺結核的患者有44例，所占的比例為40.00%（44/110）。熒光定量FQ-PCR檢測的BALF肺結核的敏感度為63.64%，特異度為96.97%，準確度為83.64%。陽性預測值=93.33%，陰性預測值=80.00%，陽性似然比=21.00，陰性似然比=0.37。FQ-PCR檢測BALF中結核桿菌-DNA結果與金標準比較見表1。

表1 熒光FQ-PCR檢測與金標準結果比較 例

2.2 三種肺結核診斷結果比較 FQ-PCR檢測的敏感性明顯高于痰涂片、刷檢涂片，三種方法診斷肺結核的敏感性比較差異有統計學意義（P<0.05），見表2。隨機20次對清洗后的支氣管鏡用無菌生理鹽水沖洗，沖洗液實時熒光定量PCR檢測結果為全陰性。

表2 三種肺結核診斷結果比較 例（%）

3 討論

在肺結核的臨床診斷中，實驗室檢查是重要的手段，通過實驗室檢查，可以將肺結核疾病的傳染源進行明確。傳統的涂片檢查，操作簡單、快速，但是其檢驗的準確性較差[6]。隨著臨床檢驗技術的發展和進步，FQ-PCR檢驗技術產生，因其具有精確、簡便、快速等優點，所以在臨床檢驗中被廣泛的應用[7]。本文FQ-PCR檢測BALF中結核桿菌-DNA對肺結核的診斷進行了分析研究，結果顯示FQ-PCR檢測BALF中結核桿菌-DNA的陽性率明顯的高于涂片、刷檢[8-9]。

在本次研究中熒光定量FQ-PCR檢測的BALF肺結核的敏感度為63.64%，特異度為96.97%，準確度為83.64%。陽性預測值=93.33%；陰性預測值=80.00%；陽性似然比=21.00；陰性似然比=0.37，顯著優于其他檢驗方法的檢查結果。FQ-PCR檢測BALF中結核桿菌-DNA的整個檢驗過程密閉進行，實現了實時動態監測，有效地減少了檢驗中的污染，減少了假陽性、假陰性的發生，其臨床診斷準確性較高。在肺結核的診斷中，FQ-PCR檢測方法的應用自動化程度較高，可以進行定性定量檢查，有較高的準確性、特異性和靈敏性，結合本次研究的結果，FQ-PCR檢測在肺結核的診斷中有較高的應用價值，可以進行推廣應用[10-12]。

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