醫用臭氧對神經病理性疼痛大鼠的鎮痛作用及初步機制探討

肖智，李尤艷，孫夢婕

(1.遵義醫學院醫學與生物學研究中心;2.遵義醫學院研究生學院;3.遵義市第一人民醫院眼科，貴州遵義 563003)

臭氧(ozone，OZ)是一種不穩定的氣體。醫用臭氧是氧和臭氧的混合物，具有強氧化性，具有消毒、滅菌和抗病毒等作用。近年來，醫用臭氧用于臨床腰椎間盤突出等疾病的鎮痛治療［1］。中腦導水管周圍灰質(midbrain periaqueductal gray，PAG)是機體內源性鎮痛系統的關鍵部位，其中PAG的外側區(lateral periaqueductal gray，lPAG)與疼痛調制的關系最為密切。lPAG中多種神經遞質和受體參與機體的下行性鎮痛或下行性疼痛易化機制。三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate，ATP)不僅是機體儲能和供能的物質，也是一種重要的神經遞質。ATP受體中對胞外腺苷敏感的受體稱P1受體，屬G蛋白偶聯受體家族，包括A1、A2A、A2B、A3四類;對胞外腺嘌呤核苷酸敏感的受體稱P2受體，其亞型又可分為P2X(離子通道型受體)和P2Y(G蛋白偶聯型受體)，已經明確的P2X受體家族有7個亞型(P2X1-7)，P2Y 受體家族有8 個亞型(P2Y1，2，4，6，11，12，13，14，)。ATP 及其受體參與機體疼痛調制，其中P2X3受體在疼痛調制中的作用研究最為深入。本課題組前期研究中發現，神經病理性疼痛大鼠lPAG中P2X3受體的活化將促進機體的內源性鎮痛作用［2］。那么，明確醫用臭氧的鎮痛作用是否有lPAG中P2X3受體的介入是本研究的目的。本實驗將通過建立慢性神經壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)的神經病理性疼痛大鼠模型，在坐骨神經旁注射不同劑量的醫用臭氧，觀察醫用臭氧是否對神經病理性疼痛具有鎮痛作用并探討其鎮痛機制是否有lPAG中P2X3受體的參與。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠共108只購于重慶第三軍醫大學，體重210～220 g，實驗期間分籠飼養，3～4只大鼠一籠;大鼠置于安靜，溫度(24±1)℃，濕度(60±5)%，人工光照，明暗各12 h/d(8AM-8PM)周期的環境中飼養，自由進食及飲水。本實驗嚴格按照國際疼痛研究協會(International Association for the Study of Pain，IASP)關于應用動物進行疼痛研究的倫理綱要進行操作，實驗過程中盡量減少動物的不適和動物的使用量。

按照隨機數字表法將84只大鼠隨機分為7組(n=12):正常組(normal)、假手術組(sham-CCI)、CCI組(CCI)、CCI加空氣注射組(CCI+Air)、低劑量臭氧組(CCI加low OZ)、中劑量臭氧組 (CCI加middle OZ)、高劑量臭氧組(CCI加high OZ)。其中CCI組、CCI加 Air組、CCI加 low OZ 組、CCI加 middle OZ組和CCI加high OZ組大鼠建立CCI神經病理性疼痛大鼠模型。在CCI手術后14 d每組取6只用于免疫組化檢測，剩余6只觀察MWT值直到CCI手術后21 d。正常組不做任何處理，僅做對照。

另取SD大鼠24只建立CCI神經病理性疼痛模型大鼠，按照隨機數字表法分為3組(n=8):CCI組(CCI)、CCI+OZ組和CCI+A-317491+OZ組。

1.2 主要實驗儀器及試劑

電子Von Frey測痛儀(IITC Life science公司，2390系列，美國)、冰凍切片機(Leica CM1950，德國)、腦立體定位儀(Narishige公司，SR-6R，日本)。兔抗大鼠 P2X3多克隆抗體 (AB5896，美國Millipore公司)、兔超敏二步法檢測試劑盒(PV-9001，北京中杉金橋生物技術有限公司)、牛血清蛋白(北京中杉金橋生物技術有限公司)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9032，北京中杉金橋生物有限公司)、A-317491(A-2979，Sigma Aldrich 公司，美國)，溶于無菌生理鹽水中，終濃度為5 nmol/μL，lPAG中微量注射量為(1.5 nmol/0.3 μL)。

1.3 動物模型建立

參照Bennett等［3］的方法制備大鼠 CCI模型。大鼠予4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射。待大鼠進入麻醉狀態后于右后肢縱向切開皮膚，鈍性分離，暴露坐骨神經主干，4.0絲線間斷結扎，間距1 mm，松緊度以小腿肌肉出現輕微震顫為標準。生理鹽水沖洗后逐層縫合。術后大鼠單籠飼養，麻醉清醒后自由飲食。假手術組大鼠僅暴露坐骨神經不予結扎，余同模型組。

1.4 坐骨神經旁注射

在CCI建模成功后8 d，CCI+low OZ組、CCI+middle OZ組和CCI+high OZ組大鼠每組取6只，分別抽取35 μg/mL 醫用臭氧 0.125 mL、0.25 mL、0.5 mL注射于大鼠損傷坐骨神經旁，1次/2d，共注射4次。CCI+Air組大鼠在坐骨神經周圍注入0.5 mL空氣，其余操作同前3組。注射部位定位方法:在大鼠股骨大轉子和坐骨結節間皮膚進針后向前內側前進，沿著坐骨神經走行呈扇形注射藥液［4］。

1.5 疼痛行為學觀察及機械痛閾值檢測

觀察各組大鼠在各觀察時間點步態和左右肢姿勢、協調程度以及有無畸形等，大鼠是否存在過分嘶叫、舔舐患肢、自噬等自殘現象。

1.6 機械痛閾值的檢測

測定機械痛閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)時，室溫維持在20～24℃，保持周圍環境安靜。先將大鼠置于底帶孔的透明有機玻璃籠中30 min以上，使大鼠適應環境30 min，待大鼠停止行走、抓撓、直立、排便等活動處于安靜狀態后開始檢測。通過網孔用電子von Frey纖維刺激大鼠后肢足底中部2 s，出現縮足反應時讀數為MWT。檢測時間點為 CCI術前(0 d)和術后1 d、2 d、8 d、10 d、12 d、14 d、18 d 和 21 d。

1.7 免疫組織化學染色

大鼠4%水合氯醛(20 mL/kg)腹腔內注射，深度麻醉后開胸暴露心臟，從左心室插管入主動脈升部，150 mL冷生理鹽水快速灌注沖洗血液后予200 mL 4%多聚甲醛緩慢灌注，維持2 h。取出大鼠腦組織置于4%多聚甲醛溶液中，6 h后轉移至30%蔗糖溶液中直至腦組織沉底。冰凍包埋劑(OCT)包埋后－20℃冰凍切片機中速凍40 min，沿大腦冠狀位連續切片，厚25μm。每5～6張PAG切片取一張進行免疫組織化學染色分析，每只大鼠取10張。3%H2O2封閉40 min，3%正常牛血清封閉1 h，加入兔抗大鼠P2X3(1∶200)，于37℃烤箱中孵育1 h后轉移到4℃冰箱中過夜。按說明書加入超敏二步法檢測試劑，用DAB進行顯色，自然風干后梯度酒精脫水，二甲苯透明;中性樹膠封片，封固后在光鏡下觀察并采集圖像。在切片放大400倍條件下，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對lPAG的陽性圖片進行陽性細胞計數。lPAG中細胞有細胞核、一個完整的胞體和細胞邊界算做一個細胞。計數每一個視野中的細胞數，每張計數5個不重疊的視野，取均值。

1.8 中腦導水管周圍灰質植管及微量注射

CCI+A-317491+OZ組大鼠在CCI術后9 d給予4%水合氯醛麻醉(10 mL/kg，腹腔注射)，麻醉成功后，大鼠俯臥位置于腦立體定位儀上，切開頭皮，暴露顱骨，鉆孔。lPAG的坐標為:前囟后7.80 mm，中線旁開0.60 mm，顱骨表面下4.5 mm。插入外直徑0.8 mm的不銹鋼插管，用牙科磷酸鋅水門釘固定，單側插管，在插管內放入一內芯，防止插管堵塞。植管后給予青霉素鈉鹽(溶于2 mL無菌鹽水)腹腔注射預防感染和脫水。手術結束后放入籠中，保溫直到麻醉蘇醒。插管完成后，每日觀察大鼠的一般情況，生命體征以及運動功能變化，如果出現神經系統功能障礙(癱瘓、呼吸異常、插管腦脊液漏)等，排除在實驗組。lPAG插管后5 d給予lPAG微量注射A-317491，注射藥物前輕度固定大鼠，用微量進樣器連接注射針頭后給予注射，注射針頭長于導管1 mm。每次注射0.3μL，3 min內注射完畢，留針2 min，確保藥物的完全擴散。整個實驗結束時，通過微量進樣器注入2% 伊文思藍0.1μL，確定注射部位并與大鼠腦圖譜［5］比對，只有注射部位位于lPAG的大鼠數據才納入統計處理。

1.9 統計學分析

應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差(x－±s)表示，不同時間點組內比較采用重復測量方差分析;多組間數據比較采用兩因素方差分析(Two-Way ANOVA)，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCI大鼠疼痛行為學變化

大鼠CCI術后健康狀況良好，體重無明顯減輕，毛色有光澤，飲食正常。術側足趾展開且輕度外翻，常抬起并貼于腹部;著地/離地時間增長;站立時以左后足持重;行走無力，呈跛行狀態。常將右后肢迅速抬起，有時出現舔舐、抓撓等，無自噬現象。正常組和假手術組未出現肢體畸形及活動異常現象。

2.2 大鼠機械痛閾值變化

CCI術后大鼠建模側后肢MWT值逐漸下降，在CCI手術后14 d達到最低值，與正常組比較，差異有統計學意義(P＜0.001);其后MWT值有小幅上升，在CCI術后21 d，與正常組比較，差異仍有統計學意義(P＜0.001);注射不同劑量的醫用臭氧后，CCI大鼠MWT值提高，在注射醫用臭氧后各觀察時間點與CCI組大鼠比較，差異均有統計學意義(P＜0.001)，且MWT提高值與醫用臭氧注射量成正相關。表明局部注射醫用臭氧對CCI大鼠有鎮痛作用。假手術組大鼠在各觀察時間點MWT值與正常組比較，差異無統計學意義;CCI+Air組大鼠在各觀察時間點其MWT值與CCI組比較，差異無統計學意義(圖1)。

圖1 各觀察時間點大鼠機械痛閾變化曲線

*P＜0.001，與同時間點正常組大鼠比較;#P ＜0.001，與同時間點CCI組大鼠比較;△P＜0.001，與同時間點CCI+low OZ組大鼠比較;▲P＜0.001，與同時間點CCI+middle OZ組大鼠比較。

圖2 ACCI或醫用臭氧治療對大鼠lPAG中P2X3受體表達的影響

2.3 P2X3受體在PAG中的表達變化

取CCI手術后14 d各組大鼠(n=6)，免疫組化染色提示:正常組和假手術組大鼠在PAG中僅有少量P2X3受體陽性細胞表達，差異無統計學意義。CCI組大鼠lPAG中P2X3受體表達增加，與正常組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);局部注射醫用臭氧后P2X3受體表達進一步上調，與CCI組比較，差異有統計學意義(P＜0.001)，且隨著臭氧注射量的增加，lPAG中P2X3受體的表達量增加;CCI+Air組大鼠lPAG中P2X3受體的表達與CCI組大鼠比較，差異無統計學意義。說明局部注射醫用臭氧可促進CCI大鼠lPAG中P2X3受體表達上調(圖2A，B)。

圖2 BCCI或醫用臭氧治療后lPAG中P2X3陽性細胞數A.正常組；B.假手術組；C.CCI組；D.低劑量臭氧組；E.中劑量臭氧組；F.高劑量臭氧組；G.CCI+空氣注射組。(Scale bars=20μm)。

2.4 A-317491對臭氧鎮痛作用的拮抗效應

取CCI建模后14 d大鼠，分為CCI組、CCI+OZ組和CCI+A-317491+OZ組(n=8)。CCI+OZ組大鼠外周注射OZ后，MWT值在注射后10 min升高到最大值，此后在觀察時間內(30 min)，MWT值無顯著變化;CCI+A-317491+OZ組大鼠給予lPAG中微量注射P2X3受體拮抗劑A-317491(1.5 nmol/0.3μL)5 min后，外周坐骨神經周圍再給予35μg/mL(0.5 mL)醫用臭氧注射。觀察發現，在醫用臭氧注射后10 min，MWT值上升達到最大值，與CCI組大鼠比較，差異有統計學意義(P＜0.001)，隨后MWT值逐漸下降，在醫用臭氧注射后30 min，其MWT值與CCI組大鼠比較，差異無統計學意義;與CCI+OZ組大鼠比較，CCI+A-317491+OZ組大鼠MWT值上升幅度減小，差異有統計學意義(P＜0.001)(圖3)。

圖3 A-317491預處理對醫用臭氧鎮痛作用的影響

3 討論

根據國際疼痛研究協會(IASP)的定義，神經病理性疼痛指由于軀體感覺系統的損傷或疾病而直接引起的疼痛，表現為自發性疼痛、痛覺過敏、感覺缺失或異常痛敏等。各種原因(包括損傷、炎癥因子、免疫因子等)引起的中樞和外周神經敏化在神經病理性疼痛的產生和維持中有重要作用［6］。醫用臭氧廣泛應用于臨床神經病理性疼痛的鎮痛治療。目前研究認為醫用臭氧的鎮痛機制包括:(1)臭氧通過其抗炎作用，減少促炎癥因子的釋放，產生鎮痛作用;(2)局部注射臭氧可以直接作用于外周神經末梢，促進腦腓肽等物質釋放達到鎮痛作用;(3)局部注射后刺激抗氧化酶的過度表達，通過清除氧自由基產生鎮痛作用。另外有研究發現，局部注射臭氧后可刺激局部組織產生類似針灸樣的療效，使體內產生內源性鎮痛物質，緩解疼痛［7］。

大量研究［8－9］表明ATP及其受體(P2X受體和P2Y受體)介入神經病理性疼痛的形成和維持過程，其中研究最多、最深入的是P2X3受體。外周神經損傷后，初級傳入神經中樞端的P2X3受體激活，促進谷氨酸、P物質等疼痛相關遞質和神經肽的釋放，產生異常性疼痛或痛覺過敏現象［10］。研究發現，神經病理性疼痛和炎癥性疼痛時，背根神經節P2X3受體蛋白的mRNA表達增加，感覺神經元P2X3受體介導 ATP激活電流明顯增強［11］。通過局部注射或鞘內注射P2X3受體特異性拮抗劑A-317491可以對CCI、脊神經結扎等神經病理性疼痛大鼠具有良好的鎮痛作用［12］。但在脊髓上結構，P2X3受體的活化產生鎮痛作用。Fukui等［13］發現炎癥性疼痛大鼠腦室內注射 ATP擬似物 αβmeATP，通過活化P2X3受體后產生鎮痛作用，而預先給予A-317491或多次注射針對P2X3 mRNA的反義寡聚核苷酸，減少P2X3受體蛋白表達，可以翻轉αβ-meATP的鎮痛作用。

本課題組前期研究發現，lPAG中P2X3受體表達上調可促進機體的內源性鎮痛系統功能，對CCI大鼠產生鎮痛作用［2］。本實驗發現:正常組大鼠lPAG中僅有少量P2X3受體陽性表達;大鼠CCI術后lPAG中P2X3受體陽性表達增加，此現象考慮為CCI手術引起的疼痛信息經上傳后激活機體的內源性鎮痛系統，引起PAG中P2X3受體表達的上調;給予醫用臭氧局部注射后CCI大鼠機械痛閾值顯著提高且P2X3受體在lPAG的陽性表達進一步增加，并與注射的醫用臭氧劑量成正相關，說明外周局部注射醫用臭氧可以促進CCI大鼠lPAG中P2X3受體的表達;本研究也發現，預先在lPAG中微量注射P2X3受體特異性拮抗劑A-317491后，可以部分翻轉醫用臭氧的鎮痛作用。值得注意的是，在對正常大鼠注射醫用臭氧后，大鼠機械痛閾及P2X3受體在lPAG中的表達與正常大鼠比較無明顯差異，說明醫用臭氧沒有參與調節正常狀態下P2X3受體在lPAG中的表達。以上研究說明:醫用臭氧至少通過促進lPAG中P2X3受體表達的途徑，促進機體的內源性鎮痛系統，進而對CCI大鼠疼痛產生鎮痛作用。Fuccio等［14］發現，外周皮下注射醫用臭氧可以影響眶額葉皮層的促炎癥因子和促凋亡因子mRNA的表達，最終對神經病理性疼痛小鼠產生鎮痛作用，但具體機制不明。結合本研究，對于外周注射醫用臭氧引起lPAG中P2X3受體表達增加的具體機制仍需進一步探索明確。

綜上，可認為注射醫用臭氧能有效緩解CCI大鼠的疼痛，為臨床采用醫用臭氧治療神經病理性疼痛提供了新的理論依據。

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