一種更符合臨床的深靜脈血栓形成大鼠模型

張朝順，柯常江，馮起校，邱海兵，覃善君

（廣東醫學院附屬中山醫院呼吸內科，廣東 中山 528415）

一種更符合臨床的深靜脈血栓形成大鼠模型

張朝順，柯常江，馮起校，邱海兵，覃善君

（廣東醫學院附屬中山醫院呼吸內科，廣東 中山 528415）

目的 建立一種新的更符合臨床的深靜脈血栓形成大鼠模型，并探討其深靜脈血栓形成機制。方法將72只SD大鼠隨機分為正常對照組(N組)、假手術組(S組)及模型組(M組)，每組24只。M組采用不完全阻滯左股靜脈血流+注入10%高滲鹽水的方法建立大鼠股靜脈血栓模型。于建模后第2、6、10天分別處死各組大鼠8只，比較各組血栓形成情況，行病理學分析，并應用放免法測定各組大鼠各時間點血漿血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)及內皮素(ET)的含量。結果建模后第2、6、10天，N組和S組均未見血栓形成，M組血栓形成率明顯高于N組和S組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。M組病理檢查可見血栓不同時期的變化及血管再通現象，且該模型各時間點血漿TXB2、ET含量均較N、S組升高(P＜0.05)，而6-Keto-PGF1α含量較N、S組降低(P＜0.05)。結論通過不完全阻滯股靜脈血流+注入10%高滲鹽水的方法，可以建立穩定的、更符合臨床的深靜脈血栓形成大鼠模型，該模型靜脈血栓形成可能與血漿血栓素A2(TXA2)/前列環素（PGI2）比例升高及ET含量升高有關。

深靜脈血栓形成；模型；大鼠；血栓素B2；6-酮-前列腺素F1α；內皮素

深靜脈血栓形成(DVT)指血液在深靜脈內不正常地凝結、阻塞管腔，導致靜脈回流障礙，多發生于下肢深靜脈。西方國家每年因DVT住院人數約65萬例，死亡人數5萬～20萬例，臺灣地區的DVT發生率約為歐美的2/3，大陸尚無對DVT發病情況的統計[1]。隨著人口老齡化，DVT發病率近年來呈明顯上升趨勢。DVT除可能引致肺栓塞(PTE)外，尚會導致慢性靜脈功能不全，引起慢性靜脈潰瘍、跛行等，影響患者生活質量，加重社會負擔[2]。DVT病變過程復雜，為明確其發病的機制及轉歸，建立合適的DVT動物模型，模擬其病理生理過程，是研究DVT的重要途徑。雖然目前已有多種DVT動物模型，但能很好的模擬人類DVT病理生理過程的動物模型仍較少。如何復制更符合臨床的DVT動物模型，是今后推進DVT防治研究的關鍵。我們通過不完全阻滯左股靜脈血流+注入10%高滲鹽水的方法，建立了一種簡單、穩定且更符合臨床的大鼠DVT疾病模型，并探討了其深靜脈血栓形成機制，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠72只，月齡4個月，體重300～400 g，平均(350±27)g，購自廣東省醫學實驗動物中心，合格證號：SCXK(粵) 2008-0002。SD大鼠飼養于動物中心實驗室動物房，室溫18℃～25℃，房間通風良好，實驗動物自由飲水及進食，適應性喂養1周后進入實驗。

1.2 實驗試劑 血栓素B2(TXB2)放射免疫分析藥盒(批號：131220)，6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)放射免疫分析藥盒(批號：131220)，內皮素(ET)放射免疫分析藥盒(批號：140102)購自北京北方生物技術研究所。

1.3 動物分組及模型的建立 72只SD大鼠，按隨機原則分為3組，每組24只。N組：正常對照組；S組：假手術組；M組：模型組。N組：不作任何操作；S組：大鼠以5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉，沿左腹股溝區中點行2 cm縱行切口，分離左股靜脈；術畢檢查周圍組織無出血后縫合切口，外敷消毒紗布；M組：5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉，沿左腹股溝區中點行2 cm縱行切口，分離左股靜脈；在左股靜脈近心端處繞以絲線不完全結扎，使血管腔縮小約1/2，以減慢血流，并自阻滯血管遠端緩慢注入10%高滲鹽水1 ml造成局部靜脈血管壁損傷。術后動物自由飲水，正常飼料飼養，不用抗凝劑及抗生素。

1.4 標本的獲取及處理 建模后第2、6、10天作為觀察時間點，在各觀察時間點每組各隨機取8只大鼠，對大鼠麻醉(麻醉方法同前)，全部大鼠心臟取血制備血漿測定TXB2、6-Keto-PGF1α、ET等各項指標，并經原切口取出病變靜脈(正常對照組逐層切開皮膚、皮下，取股靜脈)，用10%甲醛溶液固定，制成石蠟切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察組織病理學改變，并計算血栓形成陽性率。

1.5 測定指標

1.5.1 TXB2、6-Keto-PGF1α檢測 心臟取血2 ml，置于含消炎痛-EDTA·Na2液0.2 ml的塑料試管中，充分混勻，4℃，3 500 r/min，離心15 min，分離血漿，放-20℃保存。測定時采用放免法按照TXB2、6-Keto-PGF1α放免試劑盒說明書嚴格操作。

1.5.2 ET檢測 心臟取血1 ml，注入含7.5% EDTA·Na215μl和抑肽酶20μl的塑料試管中，充分混勻，4℃，3 000 r/min，離心 15 min，分離血漿，放-20℃保存。測定時采用放免法按照ET放免試劑盒說明書嚴格操作。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。各組計量資料數據以均數±標準差(±s)表示，計量資料組間的比較采用單因素方差分析及q檢驗，計數資料組間率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物存活情況 72只受試大鼠中，S組在建模時因麻醉過量死亡1只，其余71只大鼠均存活至完成實驗。

2.2 各組大鼠股靜脈血栓形成率比較 光鏡觀察各組大鼠左股靜脈血栓形成結果見表1。術后各時間點，N組和S組均未見血栓形成，術后第2、6、10天，M組大鼠股靜脈血栓形成率分別為62.5%(5/8)、87.5%(7/8)、75%(6/8)。M組血栓形成率明顯高于N組和S組，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

表1 光鏡觀察大鼠左股靜脈血栓形成結果（以靜脈數表示）

2.3 各組大鼠局部股靜脈的組織形態學觀察 N組及S組大鼠在各時間點均無股靜脈血栓形成；光鏡觀察見整個血管內膜表面平整，內皮細胞大小均勻、排列整齊，管腔內無血栓形成，管壁無炎性細胞浸潤(圖1A、B)。M組術后第2、6、10天，光鏡下股靜脈血栓病理形態見圖1C、D、E。

2.4 各組大鼠血漿TXB2、6-Keto-PGF1α、ET的對比觀察 M組各時間點血漿TXB2含量均較N、S組明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；N組與S組各時間點血漿TXB2含量比較差異無統計學意義(P＞0.05)。M組各時間點血漿6-Keto-PGF1α含量均較N、S組明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；N組與S組各時間點血漿6-Keto-PGF1α含量比較差異無統計學意義(P＞0.05)。M組各時間點血漿ET含量均較N、S組明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；N組與S組各時間點血漿ET含量比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2、表3和表4。

圖1 各組大鼠局部股靜脈的組織形態學觀察(HE×100)

表2 各組大鼠時間點血漿TXB2含量（±s,pg/ml）

表2 各組大鼠時間點血漿TXB2含量（±s,pg/ml）

注：S組第2天為7只大鼠，其他各組各時間點均為8只大鼠；與正常對照組比較，aP＜0.05；與假手術組比較，bP＜0.05。

組別N組(n=24) S組(n=23) M組(n=24)第2天352.78±18.06 362.04±11.84 506.75±31.83ab第6天350.53±15.80 364.05±16.19 578.48±36.41ab第10天351.24±19.05 348.98±15.22 512.92±24.22ab

表3 各組大鼠各時間點血漿6-Keto-PGF1α含量(±s,pg/ml)

表3 各組大鼠各時間點血漿6-Keto-PGF1α含量(±s,pg/ml)

注：S組第2天為7只大鼠，其他各組各時間點均為8只大鼠；與正常對照組比較，aP＜0.05；與假手術組比較，bP＜0.05。

組別 第2天 第6天 第10天N組(n=24)161.42±16.48165.04±26.34163.25±21.33 S組(n=23)158.48±19.92162.99±27.91160.27±19.04 M組(n=24)108.45±24.58ab80.19±14.56ab105.05±22.67ab

表4 各組大鼠各時間點血漿ET含量(±s，pg/ml)

表4 各組大鼠各時間點血漿ET含量(±s，pg/ml)

注：S組第2天為7只大鼠，其他各組各時間點均為8只大鼠；與正常對照組比較，aP＜0.05；與假手術組比較，bP＜0.05。

N組(n=24) S組(n=23) M組(n=24) 89.77±13.51 92.36±14.14 141.41±23.64ab93.86±19.42 94.53±23.39 177.86±33.98ab92.37±24.19 90.80±20.05 144.97±26.07ab

3 討論

DVT尤其是下肢的DVT作為住院患者的一項嚴重疾病及常見并發癥已越來越受到重視，具有很高的致殘率及致死率[3-4]。國外文獻報道，DVT是繼急性冠脈綜合征和中風后的第三大心血管疾病，且其發病率近年來呈明顯上升趨勢[5]。許多DVT患者并發PTE和心血管意外從而導致嚴重后果[6]。因此，深入研究DVT的發病原因、致病機制以及相關的病理生理，對于改善診治現狀，降低并發癥發生及死亡率，具有良好的經濟和社會效益。而建立簡單、價格低廉、穩定、可靠且符合臨床深靜脈血栓形成特點的DVT動物模型是研究該問題的基礎。雖然目前已有多種DVT動物模型，但均與臨床實際不盡相符，如：(1)臨床DVT絕大部分為亞急性或慢性，而現有造模方法所形成的血栓均為急性；(2)現有造模方法多為完全結扎靜脈以阻斷靜脈回流、造成血液淤滯而誘發血栓形成，這樣雖然可以形成穩定的血栓，但是不能保障血栓的近心端通暢，不適合作為對溶栓及抗血栓藥物動態研究的模型，也不符合人體靜脈血栓的發病特點(臨床絕大多數DVT發病初始并不存在靜脈回流完全阻斷)；(3)電流損傷法、機械損傷法等均直接損傷靜脈，與臨床DVT幾乎都未直接損傷深靜脈不相符，且創傷性均較大，易引起全身應激狀態而對實驗模型造成干擾，不符合自然狀態下的深靜脈血栓形成過程；(4)注入促凝物質法與臨床DVT患者多無使用促凝血藥史不相符，且部分患者在使用抗凝血藥時仍發生DVT。因此，有必要探索新的造模方法以制備出更符合臨床的DVT動物模型。

本試驗通過不完全阻滯股靜脈血流+注入10%高滲鹽水的方法建立了一種新的、穩定的、更符合臨床深靜脈血栓形成特點的大鼠DVT模型。該造模方法的血栓形成率高，形成血栓穩定可靠；與完全結扎的模型相比，此模型更符合人體DVT的病理生理學演變，且形成血栓的血管段近心端保持通暢，可有效地用于觀察藥物溶栓或抗栓塞作用的效果；與電流損傷法、機械損傷法等直接損傷靜脈的造模方法相比，注入高滲鹽水對靜脈損傷較小，更符合臨床DVT的發病特點；且光鏡觀察見模型組不同時間點形成的血栓與臨床實際形成的血栓在性質和成分上相似，能很好的模擬臨床DVT的病理生理演變過程。

TXA2和PGI2均為花生四烯酸的代謝產物，TXA2主要在血小板中經TXA2合成酶的作用下生成，而PGI2主要在血管內皮細胞中經PGI2合成酶的作用下生成。TXA2可以促進血小板激活、聚集，進而促進凝血和血栓形成，收縮血管并刺激平滑肌細胞增殖；PGI2則相反，具有很強的抑制血小板聚集的作用，它不僅預防血栓的形成，甚至能消除己經存在的血小板聚集，其作用機制是通過細胞內第二信使激活一系列酶使血小板內TXA2合成減少，從而抑制血小板聚集，PGI2還有舒張血管和抑制平滑肌細胞增殖的作用[7]。在生理狀態下，循環血液中TXA2和PGI2的濃度處于相對平衡狀態，兩者共同調節血小板聚集和血管舒縮，對維持血流通暢和血管正常張力具有重要意義。當血栓阻塞血管時，血管內皮層損傷部位聚集血小板可釋放TXA2，濃度顯著升高，TXA2/PGI2比例明顯高于平時，提示TXA2濃度升高和TXA2/PGI2的平衡失調，與血管痙攣、血小板聚集或血栓形成有密切的關系。因為二者的半衰期僅數分鐘，TXA2很快被水解為無活性的TXB2，而PGI2被迅速氧化為6-Keto-PGF1α而難以直接測定，所以一般用放免法測定血漿TXA2和PGI2的穩定代謝產物TXB2和6-Keto-PGF1α以代表其含量。本實驗結果顯示：模型組大鼠血漿TXB2水平明顯升高，而6-Keto-PGF1α水平明顯降低，與正常對照組、假手術組比較差異顯著。提示該造模方法可引致大鼠機體產生以下一系列病理改變：大鼠股靜脈不全結扎，造成局部血流緩慢，當靜脈輸入10%高滲鹽水時，血漿滲透壓升高，使血管內皮細胞脫水、低氧、充血、水腫，從而損傷血管內皮，暴露膠原纖維，觸發內源性凝血過程[8]；血小板聚集于損傷內皮部位，釋放TXA2，損傷血管內皮，PGI2生成減少，導致TXA2/PGI2比例明顯高于平時；而TXA2濃度升高和TXA2/PGI2的平衡失調又進一步加重血管痙攣、血小板激活、聚集和血栓形成。

ET主要由粒細胞、巨核細胞分泌，參與廣泛的生理病理過程的調控，對細胞功能、炎癥反應等具有重要作用，通過影響內皮細胞等改變血管功能和結構。ET是1988年首先由日本學者Yanagisawa等從培養的豬主動脈內皮細胞的上清液中分離純化獲得的，是一種含有21個氨基酸的血管活性肽，共有4個亞型，即ET-1、ET-2、ET-3和ET-4，是目前己知的作用最強的血管收縮因子[9]。血管損傷是DVT形成的主要原因之一，而血管內膜的損傷是DVT形成的啟動因素。完整的血管內膜具有良好的抗血栓功能，當內皮細胞受損后，ET合成增加，血漿ET含量增加，血管內膜抗凝功能減弱，致使凝血和抗凝功能動態平衡失調，最終導致血栓形成，所以血漿ET含量增加是在DVT形成過程中血管內膜細胞損傷的直接反映和客觀指標。本實驗結果顯示：模型組大鼠血漿ET水平明顯升高，提示10%高滲鹽水損傷了血管組織，血管各系統反應性的釋放ET，導致血液中ET增多，血管張力增大，血管痙攣，血流緩慢，從而促進了血栓形成。

綜上所述，通過不完全阻滯股靜脈血流+注入10%高滲鹽水的方法可以建立穩定的大鼠DVT疾病模型，與完全結扎的模型比較，此模型更符合人體DVT的病理生理學演變，更適用于DVT的基礎研究。該模型靜脈血栓形成可能與血漿TXA2/PGI2比例升高及ET含量升高有關，提示臨床上動態監測血漿TXB2、6-Keto-PGF1α、ET含量可能有助于DVT的早期診斷。

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A rat model of deep venous thrombosis more consistent with the clinical practice.

ZHANG Chao-shun,KE Chang-jiang,FENG Qi-xiao,QIU Hai-bing,QIN Shan-jun.Department of Respiratory Diseases,the Affiliated Zhongshan Hospital of Guangdong Medical College,Zhongshan 528415,Guangdong,CHINA

Objective To establish a rat model of deep venous thrombosis which is more consistent with the clinical practice,and to investigate the possible mechanism of deep venous thrombosis.MethodsSeventy-two Sprague-Dawley rats were randomly and equally divided into 3 groups(N,S,M),with group N defined as control group.The rats in the group S underwent sham operation.In the group M,the left femoral vein of the rats was incompletely ligated in combination with injection of 10%hypertonic saline from the distal end of the incompletely ligated femoral vein.On the 2nd, 6thand 10thday,8 rats from each group were sacrificed,the femoral vein was collected for observing the formation of the thrombosis and pathological analysis,and the plasma contents of thromboxane B2(TXB2),6-keto-prostaglandin F1α(6-keto-PGF1α)and endothelin(ET)were measured by radioimmunoassay.ResultsOn day 2,6 and 10,no thrombosis was observed in group N or group S.The rate of thrombosis formation in group M(62.5%,87.5%and 75%on day 2, 6 and 10)was significantly higher than those in group N and group S(P＜0.05).The changes of thrombosis at different periods and the vascular recanalization were observed by pathological examination in group M.At each time point, the plasma contents of TXB2and ET in group M were significantly higher than those in group N and group S(P＜0.05),and the plasma content of 6-keto-PGF1αin group M was significantly lower than those in group N and group S(P＜0.05).ConclusionA rat model of deep venous thrombosis which is stable and more consistent with the clinical practice can be established by incomplete ligature of the femoral vein combined with injection of 10%hypertonic saline from the distal end of the incompletely ligated femoral vein.The formation of thrombosis in the model may be associated with the thromboxane A2(TXA2)/Prostacyclin(PGI2)ratio increased and the content of ET increased in rat plasma.

Deep vein thrombosis;Models;Rat;TXB2;6-Keto-PGF1α;Endothelin(ET)

R-332

A

1003—6350（2015）05—0625—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.05.0226

2014-08-26)

廣東省醫學科研課題(編號：B2011366)；中山市科技計劃項目(編號：20113A096)

馮起校。E-mail：zhangcs790622@163.com