吡非尼酮滴眼液在兔眼小梁切除術后抗瘢痕作用研究*

邵毅，余瑤，裴重剛，胡佩宏，楊璐，黃歆，涂萍

（1.南昌大學第一附屬醫院 眼科，江西 南昌330006；2.南方醫科大學附屬南昌第三醫院 內分泌科，江西 南昌330009）

術后結膜傷口愈合不良是青光眼濾過術晚期失敗的主要原因[1]。有些疤痕體質的患者，盡管使用高濃度的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）或絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）仍可能導致晚期濾過泡形成失敗[2]。青光眼濾過術后的傷口瘢痕問題，已成為眼科的熱點和難點，因此，尋找安全、有效、副作用小的抗瘢痕藥物極為關鍵[3]。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一種新型抗纖維化藥物，動物模型和臨床試驗已證明其具有抗纖維化的潛力[4]。PFD能下調轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）及結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）[5]，也可以清除活性氧，從而抑制組織修復[6]。在人視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞，PFD可以阻止TGF-β1誘導的纖連蛋白合成[7]。此外，PFD能抑制白介素-1誘導的金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metallopro teinases 1，TIMP1），增加甲狀腺相關眼病患者眼眶成纖維細胞的抗纖維化作用[8]。而本研究旨在探討PFD在兔小梁切除術后抑制結膜濾過泡瘢痕化的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 PFD滴眼液的制備

將PFD粉末（P2116，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）溶解于無菌水中，配成濃度約5mg/ml（0.5%）的溶液，保存于4℃冰箱內，有效時間為24 h。

1.2 手術方法和分組

26只新西蘭白兔，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，檢查無眼部疾患及全身器質性疾病。2只作為陰性對照組。所有實驗操作過程和方法均遵循ARVO委員會規定的眼科和視覺科學相關的動物使用原則，符合動物倫理委員會標準，并經南昌大學第一附屬醫院動物倫理委員會許可。兔子飼養在18～25℃標準的恒溫動物箱內，12 h光照/黑暗周期，同時給予標準的食物和水進行喂養。24只兔子（24只眼，均為右眼）隨機分為兩組：所有兔經腹膜內注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）和局部用0.5%的鹽酸丙美卡因表面麻醉，0.5%碘伏消毒。鋪巾開瞼，剪去第3眼瞼，置上、下、內、外直肌牽引線，固定眼球，在顯微鏡手術條件下，于右眼上象限鞏膜區進行常規小梁切除術。約1/2厚的梯形鞏膜瓣，大小約4mm×3mm×3mm，切除約1.5mm×3.0mm的小梁組織和部分虹膜組織，用10-0尼龍線縫合鞏膜瓣和結膜瓣，手術結束時結膜下注射地塞米松1ml。A組給予0.5%（5mg/ml）PFD滴眼液滴眼，B組給予磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）滴眼，連續使用28 d。所有手術均在手術顯微鏡（VISU150，卡爾蔡司，德國）下進行，并由同一熟練操作者完成，術后涂紅霉素眼藥膏。此外，術后1周用諾氟沙星滴眼液點手術眼，3次/d。隨訪至術后28 d。用0.5%鹽酸丙美卡因麻醉后，用Tonocon眼壓計記錄兔雙眼眼壓。手術后1、7、14、21和28 d分別觀察兔眼濾過泡及并發癥，共聚焦顯微鏡檢查兔眼濾過泡情況，同時使用實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）對比觀察手術區的組織變化。

1.3 共聚焦顯微鏡檢查

采用Confoscan 4裂隙掃描共聚焦顯微鏡（Nidek Co.LTD，日本）檢查。操作步驟[9]：待檢兔眼表面麻醉后，將兔頭部固定顯微鏡前，雙眼固視正前方，檢查者移動鏡頭使共焦顯微鏡與結膜上皮細胞接觸時，將鏡頭緩慢向前推進，于結膜濾過泡區進行全層掃描，結束后選擇有價值的圖像和錄像存盤，并計算平均微囊密度及平均微囊面積[10]。

1.4 實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應

手術后7、14、21、28和56 d，取濾過泡區的組織（包括結膜、筋膜和鞏膜）進行CTGF的RT-PCR[3]。每個時間點得到的組織在1m l提取試劑（Trizol試劑，武漢生命技術有限公司，中國）中勻漿，用cDNA合成試劑盒（Toyobo，日本）合成cDNA。在實時PCR檢測系統（SLAN紅石醫藥科技有限公司，中國），使用SYBR預混的Taq試劑盒進行實時PCR測定。通過比較閾值循環方法進行結果分析，并通過管家基因β-actin進行標準化。

1.5 統計學方法

采用Graph Pad Prism 4.00統計軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，比較兩組眼壓差異、結膜囊泡密度和面積等用單因素方差分析Studentt檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 濾過泡情況

A組術后第7天可見有輕微的結膜充血和良好的濾過泡存在，術后14 d，結膜稍充血，濾過泡形成良好，觀察28 d后沒有明顯的炎癥反應，濾過泡仍隆起、彌散；B組術后第7天可見結膜充血和良好的濾過泡，術后14 d，結膜充血減輕，濾過泡平坦，瘢痕形成，觀察28 d后大部分濾過泡瘢痕化。術后1、7和14 d兩組的濾過泡評分比較，差異均無統計學意義（t1d=0.326，t7d=0.652，t14d=0.959，均P>0.05）；術后21和28 d兩組的濾過泡評分比較，差異均有統計學意義（t21d=9.142，t28d=15.741，均P<0.05）（見表1）。觀察兩組無一例眼內炎、前房出血和白內障發生，少數出現傷口一過性的周圍角膜水腫。

2.2眼壓

手術前和手術后1、7、14、21和28 d的早上8～9點測定眼壓。在術前每組眼壓與正常對照組比較，均有明顯降低（tA=6.732，tB=6.837，均P<0.05）。術后早期眼壓明顯降低，但隨時間延長逐漸升高。術前及術后1和7 d，兩組眼壓比較，差異均無統計學意義（t術前=0.352，t1d=0.647，t7d=0.753，均P>0.05）；術后14、21和28 d，兩組眼壓比較，差異均有統計學意義（t14d=3.463，t21d=4.056，t28d=5.194，均P<0.05）。見表2。

2.3 共聚焦顯微鏡結果

正常結膜上皮基底細胞顯示為光暗的細胞體，細胞邊界窄（見圖1A）。經過0.5%PFD滴眼液處理28 d的A組在結膜濾過泡區上皮及基質層出現了許多大小不一的微囊泡，周邊可見部分呈亮光樣炎癥細胞包繞（見圖1B）；而經過PBS處理的B組在結膜濾過泡區上皮及基質層可見少許的小微囊泡及少量的亮光樣炎癥細胞（見圖1C）。通過計數發現，經過治療28 d后，A組結膜上皮下平均微囊密度和平均微囊面積分別為（112±22）個/mm2和（28 589±14 268）μm2，而B組結膜上皮下平均微囊密度和平均微囊面積分別為（26±19）個/mm2和（4 989±2 329）μm2，兩組比較差異有統計學意義（tmd=16.842，tma=14.894，均P<0.05，見圖1D，1E）。

2.4 mRNA檢測

A組術后各時間點在濾過泡區CTGFmRNA表達明顯下調，而B組CTGF在濾過泡區CTGF mRNA未見明顯改變，兩組在各時間點比較差異有統計學意義（t7d=2.476，t14d=4.892，t21d=7.638，t28d=9.452，均P<0.05），見圖2。

表1 實驗動物術前和術后各時段兔結膜濾過泡評分比較 （n=12，±s）

表1 實驗動物術前和術后各時段兔結膜濾過泡評分比較 （n=12，±s）

組別 術前 術后1 d 術后7 d 術后14 d 術后21 d 術后28 d A-3.26±0.14 3.72±0.46 3.66±0.65 4.32±0.64 4.17±0.73 3.36±0.25 3.66±0.38 3.23±0.29 3.18±0.43 2.51±0.37 t值 - 0.326 0.652 0.959 9.142 15.741 P值 - 0.973 0.652 0.326 0.048 0.025 B -

表2 實驗動物術前和術后各時段眼壓比較 （n=12，mmHg，±s）

表2 實驗動物術前和術后各時段眼壓比較 （n=12，mmHg，±s）

組別 術前 術后1 d 術后7 d 術后14 d 術后21 d 術后28 d A 16.24±0.26 12.81±0.38 13.26±0.41 13.45±0.36 13.84±0.43 14.15±0.51 17.46±0.22 12.52±0.42 13.52±0.47 14.57±0.52 16.22±0.58 17.28±0.62 t值 0.352 0.647 0.753 3.463 4.056 5.194 P值 0.982 0.864 0.745 0.044 0.028 0.016 B

圖1 兩組術后28 d兔結膜濾過泡的共焦顯微鏡圖像

圖2 兩組兔結膜手術區CTGF mRNA表達

3 討論

青光眼是導致不可逆性盲的主要原因，是僅次于白內障導致失明的第2大常見原因，發病率約為0.21%～1.64%[11]。目前，濾過性手術仍是青光眼的主要治療手段，但鞏膜表層、Tenon囊和球結膜之間成纖維細胞增生、膠原合成增加等，使濾過道瘢痕化而影響其濾過功能[12]，導致手術失敗。為了抑制瘢痕形成，防止濾過道瘢痕化，目前術中常用的抗代謝藥物如5-FU和MMC均可以防止術后瘢痕形成，但常常會導致結膜泡漏、低眼壓、鞏膜溶解、眼內炎等并發癥[13]。此外，研究者發現皮質類固醇可以減少濾過道纖維細胞增生。尹寶存[14]采用濾過性手術聯合局部點用皮質類固醇藥物治療急性閉角型青光眼急性發作及慢性閉角型青光眼，有效地解決了術后炎癥和傷口愈合過程中纖維組織增生、濾過道瘢痕化的難題。但其在低濃度時不僅不能抑制成纖維細胞增殖，反而能起到促進作用，局部低濃度滴藥造成濾過道的纖維化，而結膜下注射易形成無功能濾過泡，且長期應用并發癥多。

術后濾過道瘢痕化是青光眼濾過手術后期失敗的主要原因，是眼壓長期有效控制和視神經損害保護的一個重大障礙。近年來，抗濾過道瘢痕化藥物作用被越來越多的人肯定，手術聯合各類抗瘢痕藥物的優勢也逐漸凸顯，在拓寬了手術適應范圍的同時，也保證了手術的成功率，增加了青光眼患者復明的希望。PFD在體外的很多細胞（例如肝星狀細胞、腎成纖維細胞、子宮肌層細胞及肌瘤細胞）和許多器官（例如腎、肺和肝臟）有抗炎和抗纖維化的作用。目前，PFD在若干臨床試驗中得到了應用，包括肥厚性心肌病、肺纖維化、神經纖維瘤、子宮平滑肌瘤、特發性硬皮病、硬化性腹膜炎和輻射誘發的纖維化等。雖然PFD在眼部的抗纖維化機制仍不清楚，但有研究表明，PFD能下調人眼球筋膜成纖維細胞TGF-β1的mRNA的表達，對其增殖、遷移及其在體外的膠原收縮具有明顯的抑制作用。前期已經研究了青光眼與全身疾病如阿爾默海茨病[15]、帕金森病[16]等的關系，以及一部分抗瘢痕的物質如紅花保存羊膜[3]、晶狀體前囊膜等[17]在青光眼的應用，目前的初步研究結果發現PFD能調節青光眼小梁切除手術區的鞏膜瓣和結膜組織CTGF mRNA的表達，且濾過泡形成良好，有明顯的抗瘢痕作用。

總之，本文通過實驗對照，發現PFD滴眼液在兔小梁切除術后能減少術后結膜鞏膜間的瘢痕愈合。其原因可能是青光眼小梁切除術后濾過泡容易粘連而產生瘢痕化，而PFD滴眼液能有效抗瘢痕，保持濾過道通暢，所以濾過泡存活得更為持久。隨著細胞生物學、分子生物學、組織工程學的建立及學科間的交叉發展，闡明青光眼濾過道愈合的過程，進一步研究現有抗纖維化藥物抗瘢痕化的作用機制，尋找療效好、毒副作用小、來源豐富的成分，仍是青光眼術后抗瘢痕化的研究方向。目前，大多數研究還處于體外和動物實驗階段，尚有待于進一步明確PFD對青光眼濾過道瘢痕化作用的相關機制和細胞信號通道，這將為臨床隨機對照試驗的研究奠定可靠的基礎。

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