靶向乳腺癌的多西他賽殼聚糖納米粒抑瘤作用研究

李慶

（長沙衛生職業學院，湖南 長沙410100）

多西他賽（docetaxel，DTX）為第二代紫杉烷類半合成的新型抗腫瘤藥物[1]，其作用機制是通過刺激導管素的聚合，促進微管雙聚體裝配成微管，并致使細胞增殖停止在有絲分裂靜止期（G2/M）的階段。目前已經成為激素難治性前列腺癌、乳腺癌及非小細胞肺癌等的一線治療藥物。由于多西他賽水溶性較差[2]，目前臨床上應用的唯一劑型是由40 mg/ml DTX和1 040mg/m l Tween 80組成的注射劑，臨用前用13%的乙醇為專用溶劑復溶。由于Tween 80在體內會產生嚴重的變態反應，臨床上需預先服用抗組胺劑和糖皮質激素，加之Tween 80會干擾DTX與血清白蛋白以濃度依賴的形式結合，改變藥物的體內行為，使其呈非線性藥物動力學[3]。

殼聚糖（chitosan，CS）作為優良的天然聚陽離子材料，具有良好的可生物降解、生物相容等性能，己被用于藥物控釋、靶向以及智能給藥等多種藥物載體的研究。腫瘤組織與正常組織在結構、基因表達及生物因子表達等方面存在差異，腫瘤細胞表面或其新生血管表面存在一系列特異表達或過度表達的抗原或受體，這些抗原或受體可以作為腫瘤靶向藥物載體系統的結合靶點[4]。整合素作為細胞黏附分子家族，在腫瘤組織中廣泛表達，其與細胞外基質配體結合特異性的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid，RGD）序列[5]，因此該特異性序列可作為腫瘤特異性靶點，介導靶向藥物與腫瘤組織的識別、結合與相互作用。

本研究試圖制備一種靶向乳腺癌組織的空間穩定性多西他賽殼聚糖納米粒，以期改善傳統藥物劑型的不良影響，實現多西他賽的體內長循環，改善其在重要器官和腫瘤組織中的分布，減輕不良反應，同時提高其對腫瘤的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 殼聚糖和多西他賽購自美國Sigma公司；艾素購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；人乳腺癌細胞株MCF-7由中南大學細胞生物中心提供；氯仿、無水甲醇和乙酸乙酯等溶液均為分析純。

1.1.2 主要儀器和耗材 SENCO-SHB（Ⅲ）水循環真空泵和RE-852旋轉蒸發儀購自上海亞榮儀器公司；Ⅳ92-11超聲細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；微脂粒擠壓器為美國Avanti Polar Lipids公司產品；Ultracel YMl00超濾管為美國Millipore公司產品；高效液相色譜分析儀為日本島津公司產品；二氧化碳培養箱為日本Sanyo公司產品；JEM-1200EXⅡ型透射電子顯微鏡為日本leol公司產品；Zeta Plus型Zeta電位及顆粒粒度分析儀為英國馬爾文公司產品。

1.1.3 實驗動物 SPF級BALB/c雌性裸鼠，4周齡，體重為（18±2）g。清潔級昆明小鼠，雌雄各半，4周齡，體重為（22±2）g。以上兩種小鼠均購自中南大學動物實驗學部，合格證編號分別為2007000502449和2007000506816。將乳腺癌細胞MCF-7培養至對數生長期，胰酶消化，然后用無血清培養液稀釋成細胞懸液，取1×106個（0.1ml）細胞接種于BALB/c裸鼠右腋皮下。腫瘤大小按以下公式計算：腫瘤體積V（mm3）=a×b2/2，其中a為實體瘤最長徑（mm），b為實體瘤最短徑（mm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 RGD接枝殼聚糖形成RGD-CS[6]酰化反應偶聯RGD與CS形成RGD-CS。稱取RGD肽20.0mg，用1% HAc-NaAc緩沖液（pH 6.0）2m l溶解。加入EDC·HCl 100mg，NHS 50mg，在4℃下磁力攪拌，活化12 h。稱取相對分子質量為50×103的CS 20mg溶于適量1%HAc溶液中，攪拌溶解。用1%NaOH溶液調節pH至6.0，得到黃色澄清溶液。在攪拌下，緩慢滴入活化的RGD溶液中。4℃下繼續攪拌24 h。將反應液轉移至透析袋中，用去離子水透析3 d，每12 h更換1次透析液。透析完畢后，產物凍干待用。

1.2.2 多西他賽殼聚糖納米粒的制備 采用分散-交聯法制備。精密稱量多西他賽溶于1%醋酸溶液，超聲溶解后，將殼聚糖細粉溶于其中配成一定濃度的殼聚糖溶液，靜止除去氣泡后用注射器緩緩滴入攪拌的混合油相中。分散一定時間后，加入一定量用戊二醛飽和的交聯劑，固化。將產物分別用異丙醇、亞硫酸氫鈉、石油醚洗滌3次，抽濾后，40℃干燥6 h，所得產物即多西他賽殼聚糖納米粒（CS-DTX）。

同樣條件下，采用RGD接枝殼聚糖（RGD-CS）與多西他賽制備靶向多西他賽殼聚糖粒（RGD-CS-DTX）。

1.2.3 檢測多西他賽殼聚糖粒的包封率及物理性狀

制備的多西他賽殼聚糖納米粒經超濾（10 000 r/min，1 h）后，收集下清液，高效液相色譜法測定其中的多西他賽含量，記為ρ 游離。等容量殼聚糖經醋酸完全破膜后，測定其中的多西他賽含量，記為ρ 總。高效液相色譜法測定時，色譜柱為Diamond ODSC18柱（北京迪科馬科技有限公司產品），流動相為甲醇：水（80：20），檢測波長為227 nm，流速為1.0ml/min，進樣量為20μl。在此色譜條件下，多西他賽的保留時間約為6.8min。包封率=（ρ 總-ρ游離）/ρ 總×100%。透射電子顯微鏡下觀察納米粒的形狀特征，并用顆粒粒度分析儀測定其粒徑分布。

1.2.4 檢測多西他賽殼聚糖納米粒的藥物動力學和組織分布 荷瘤裸鼠模型的腫瘤大小生長至約100～200mm3時，分別單劑量尾靜脈注射艾素、CS-DTX和RGD-CS-DTX（多西他賽劑量均為10 mg/kg），分別于注射后0.15、0.5、1、2、4、6、9和12 h（每個時間點各3只小鼠）時，摘除眼球取血，血液經抗凝處理，然后離心取血漿，于-80℃保存。藥物注射后0.5、1、2、4、6和9 h這6個時間點，取小鼠的心、肝、脾、肺、腎及腫瘤組織，清洗稱重，-80℃保存。取樣結束后以頸椎脫臼法處死小鼠。血漿樣品中加入無水甲醇，充分沉淀蛋白，離心取上清液，真空旋轉蒸干，殘留物用流動相溶解，高效液相色譜法檢測多西他賽含量（方法同1.2.3）。組織樣品加入勻漿液Tris-HCl（0.01mol/L）0.9ml，充分勻漿，勻漿液用乙酸乙酯萃取、離心后收集上層有機溶液，真空旋轉蒸發，殘留物用流動相溶解，高效液相色譜法檢測多西他賽含量。然后分別將艾素、CS-DTX和RGD-CSDTX組血漿、組織的時間-藥物濃度數據輸入藥代動力學3p87程序，以赤池信息準則（akaike information criterion，AIC）和擬合優度（r2）為判別指標，確定藥物分布模型。根據各組織時間-多西他賽濃度數據，計算得出各組織的藥物濃度-時間曲線下面積（area under curve，AUC），表示各組織中多西他賽累積總量。藥物靶向效率（targeting efficiency，t）=AUC組織/AUC血，腫瘤組織相對攝取量=AUC腫瘤/AUC組織。

1.2.5不同劑型多西他賽的毒性實驗 昆明小鼠在適應實驗室環境1周后，給予正常飲食，并隨機分為4組。24 h內分別尾靜脈注射艾素、CS-DTX和RGD-CS-DTX，同時以注射等體積的0.9%氯化鈉溶液作為對照組。觀察期至注射后第7天，每天測量小鼠體重，觀察結束后與給藥前體重比較，以體重降低≤10%的最高劑量作為最大耐受量，體重降低>20%的最高劑量作為致死劑量。預實驗中，每組2只小鼠，起始劑量為10mg/kg，若小鼠觀察期內未出現死亡或未達到體重降低10%，則增加注射劑量。艾素遞增劑量為5mg/kg，脂質體制劑遞增劑量為10mg/kg，直到小鼠出現體重降低10%，且未出現致死劑量反應時，則以每組10只小鼠在該劑量下重復實驗，確定最大耐受量。

1.2.6 不同劑型多西他賽的體內抑瘤作用 荷瘤裸鼠模型建立7 d后（此時記為d 1），隨機分為6組，每組5只，分別尾靜脈給藥。組1：0.9%氯化鈉溶液等體積注射，作為陰性對照；組2：艾素10mg/（kg·d）（共60mg/kg）；組3：CS-DTX 10mg/（kg·d），d1～6（共60 mg/kg）；組4：RGD-CS-DTX 5mg/kg，d1～6（共30mg/kg）；組5：RGD-CS-DTX間隔給藥10mg/（kg·d），d1，d3，d5（共30mg/kg）；組6：RGD-CS-DTX 10mg/（kg·d），d1～6（共60mg/kg）。d7起密切觀察荷瘤小鼠的一般狀況，每周2次測量體重和腫瘤體積。待腫瘤大小超過2 000mm3，達到小鼠最大荷瘤狀態時結束觀察，小鼠稱重并摘除眼球取血，頸椎脫臼法處死，剝離腫瘤，記錄瘤重。腫瘤抑制率計算公式：抑制率=（1-給藥組瘤重/對照組瘤重）×100%。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對實驗數據進行統計學分析。定量數據以均數±標準差（±s）表示，不同組別問比較采用單因素方差分析和LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多西他賽殼聚糖納米粒的包封率及物理性狀

超濾法測得多西他賽納米脂質體的包封率為（96.84±3.74）%。透射電子顯微鏡下觀察可見，CS-DTX及RGD-CS-DTX均呈圓形囊泡樣結構，大小較一致，分散均勻（圖1）。粒徑分布檢測結果顯示，CS-DTX及RGD-CS-DTX的平均粒徑分別為（84.2±22.6）nm和（95.2±28.5）nm。見圖2。

2.2 多西他賽回收率

高效液相色譜法檢測后，以峰面積A對質量濃度C（μg/ml）進行線性回歸，結果顯示濃度C在0.192～26μg/m l內峰面積A呈良好線性關系，回歸方程為A=84826C+4673，r2=0.9999。精密配制質量濃度為0.195、1.56和12.5μg/m l的多西他賽標準溶液，于1 d內重復測定3次，得日內精密度的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為（3.12±1.34）%（n=9）；于數天內重復測定3次，得日間精密度RSD為（3.62±1.27）%（n=9）。用多西他賽濃度測定法計算回收率：精密量取空白脂質體溶液1.0ml，加入適量的多西他賽對照品，使得脂質體中多西他賽質量濃度為0.195、1.56和12.5μg/ml，依法操作測定多西他賽濃度，多西他賽平均回收率為（99.16±3.87）%（n=9）。

圖1 CS-DTX及RGD-CS-DTX的透射電子顯微鏡下觀察圖（醋酸鈾染色，×30 000）

圖2 CS-DTX及RGD-CS-DTX的粒徑分布圖

2.3 藥物動力學和組織分布

藥物動力學分析以1/c2為權重，對數據進行模型嵌合，結果顯示艾素和多西他賽脂質體均呈二室模型。相比艾素，殼聚糖劑型的半衰期（half-lifetime，t1/2）明顯延長，清除率降低，AUC0-∝增高，平均滯留時間延長（P均<0.05）。提示藥物循環時間延長，清除減慢，進入血液循環的總量增加，體內達到長循環，從而有更多的藥物能有效地從血循環分布到靶器官。RGD-CS-DTX與CS-DTX相比，各藥物動力學參數無明顯差異，提示血管靶向多肽復合物的加入未影響藥物在體內的藥物動力學（表1）。

組織分布檢測結果顯示，艾素組各組織中多西他賽含量隨時間延長而迅速降低，6 h后僅有微量濃度檢出；而CS-DTX及RGD-CS-DTX組各組織中多西他賽清除較艾素組緩慢，9 h后仍測出較高濃度，其中肝、脾及腫瘤組織中多西他賽含量較高，尤其在腫瘤組織中，多西他賽含量可較長時間地保持高水平，清除較慢。RGD-CS-DTX經尾靜脈注射后，腫瘤組織靶向效率提高，RGD-CS-DTX、CS-DTX及艾素組Te腫瘤/血分別為2.42、1.07和0.35（P均<0.05，表2），提示腫瘤主動靶向多西他賽納米脂質體能增強藥物的靶向能力，使藥物更多地分布于腫瘤組織，而其他正常器官則分布相對較少；腫瘤組織相對于心、肺、腎的攝取率明顯增高，RGD-CS-DTX組相比CS-DTX和艾素組的AUC腫瘤/AUC心、AUC腫瘤/AUC肺和AUC腫瘤/AUC腎均有明顯提高（均P<0.05，表2）。

表1 不同劑型多西他賽（10mg/kg）在靜脈注射后的體內藥物動力學參數

表2 不同劑型的多西他賽在荷瘤裸鼠模型體內分布的靶向效率和腫瘤組織相對攝取比

2.4 最大耐受量

給予昆明小鼠不同劑型的多西他賽后發現，艾素給藥組小鼠先出現短暫的興奮，隨后出現臥伏和運動減少，10min后恢復正常；殼聚糖給藥組小鼠未出現異常反應。0.9%氯化鈉溶液對照組小鼠無死亡，體重無明顯降低；艾素、CS-DTX和RGD-CS-DTX的最大耐受量分別為35、220和220mg/kg，且雌雄小鼠無差別。

2.5 體內抑瘤作用

荷瘤小鼠給予不同劑型、不同劑量和不同給藥間期的多西他賽7 d后（記為d 7），密切觀察腫瘤生長情況，繪制腫瘤生長曲線（圖3A）。d 7時對照組的瘤體大小均超過2 000mm3，因此結束觀察，摘除腫瘤，測瘤重（圖3B），計算抑瘤率。計算結果顯示，給予艾素60mg/kg治療時，脂質體組的抑瘤率>艾素組，而RGD-CS-DTX的抑瘤作用優于CS-DTX（P<0.05）；當RGD-CS-DTX低劑量給藥或延長給藥間期時，其抑瘤作用也優于CS-DTX（P<0.05，表3）。

表3 艾素、CS-DTX及RGD-CS-DTX的抑瘤率

圖3 給予不同劑型的多西他賽治療后荷瘤裸鼠體內腫瘤的生長曲線和剝離后照片圖

3 討論

目前，化療已成為腫瘤治療的重要手段之一。然而，化療藥物由于缺乏作用的選擇性而常損傷正常器官，引起嚴重的全身不良反應。主動靶向的納米殼聚糖因具有下列特點而成為化療藥物的良好載體：①殼聚糖體具有生物相容性，毒性較小；②納米粒徑的殼聚糖易透過血液屏障到達靶器官，且比表面積大，能在其表面偶聯大量的效應分子；③聚乙二醇（polyethylene glyol，PEG）修飾的長循環脂質體被肝脾吞噬明顯減少，在血液中有足夠的循環半衰期；④靶向配體與殼聚糖相連，不影響脂質體內包封藥物的結構和生物學特性，且載藥量大；⑤通過配體—受體作用，特異靶向腫瘤組織，使藥物濃聚于靶器官，增強靶細胞對藥物的結合，減少其他器官的分布[7-8]。

整合素介導細胞與細胞外基質的相互作用，在腫瘤細胞生長、遷移及腫瘤新生血管生成中發揮重要作用。整合素為跨膜異二聚體糖蛋白，能與細胞外基質配體結合，其識別位點包含特異性的RGD序列。含有RGD序列的多肽配體，能競爭結合位點，抑制整合素功能，作為主動靶點介導藥物與腫瘤組織的特異性識別和結合。殼聚糖作為一種天然陽離子聚合物的藥物載體，具有細胞毒性低、生物相容性好及基因免疫性低等優點。但其細胞攝取效率較低，生物靶向性較差，因而也限制了它在臨床上的應用。本研究將殼聚糖和RGD肽通過化學鍵連接，以納米粒子形式包載多西他賽，其腫瘤細胞的靶向效率明顯高于單純的殼聚糖。表明RGD肽對細胞表面的靶向結合作用能增強殼聚糖輸送藥物進入細胞內部發揮生物學作用。殼聚糖-RGD納米粒同時具有殼聚糖和RGD肽的優點，顯示出了很強的應用價值。

此外，本實驗制備的多西他賽殼聚糖納米粒CS-DTX和RGD-CS-DTX，在血漿中循環半衰期明顯延長，腫瘤組織濃聚明顯增加，未見明顯的肝、脾攝取，且心、肺、腎攝取也明顯降低，因此其對重要器官的毒性降低，藥物最大耐受量明顯提高。推測其主要原因，可能如下：①制備的PEG修飾的多西他賽殼聚糖納米粒<100 nm，減少了血漿調理素、網狀內皮細胞與脂質體的相互作用，肝、脾攝取減少；②多西他賽殼聚糖納米粒的相對分子質量較大，不易通過腎毛細血管濾過，腎臟代謝降低；③腫瘤組織的增強滲透和滯留作用（enhanced permeation and retention，EPR）使多西他賽殼聚糖納米粒易于聚集在腫瘤組織中，CS-DTX與RGD-CS-DTX的腫瘤攝取量均高于艾素；④連接RGD肽的RGD-CS-DTX特異性結合至腫瘤組織表達的整合素受體，腫瘤攝取百分比約為CS-DTX和泰素的2和4倍。

本研究中體內療效觀察發現，艾素、CS-DTX和RGD-CS-DTX各給藥組均有抑瘤作用，給藥后一段時間內艾素組的腫瘤生長逐漸與對照組呈相同增長趨勢，在觀察結束時其瘤重與對照組無顯著差異；相反，各脂質體給藥組的腫瘤生長保持相對緩慢。脂質體組內分析結果顯示，RGD-CS-DTX予以高、低劑量或間隔給藥，其抑瘤作用均優于CS-DTX（P<0.05）。組織分布檢測結果顯示，RGD-CS-DTX的腫瘤組織靶向效率約為CS-DTX的2倍（P<0.05）；予以CS-DTX劑量1/2的RGD-CS-DTX時，后者的抑瘤作用仍優于前者，這與組織分布靶向效率結果一致。推測RGD-CS-DTX通過受體一配體結合作用，介導靶細胞結合載藥脂質體，藥物濃聚于腫瘤組織，從而達到更強的抑瘤作用。藥代動力學分析結果顯示，RGD-CS-DTX及CS-DTX的消除半衰期t1/2β明顯長于艾素，因此延長其給藥間隔時藥物仍能維持一定的抑瘤有效濃度，RGD-CS-DTX間隔給藥組的療效顯著優于艾素及CS-DTX組。

綜上所述，本研究制備的乳腺癌靶向的多西他賽殼聚糖納米粒，可有效改善多西他賽藥物的體內分布，提高其體內安全性和療效，有望成為一種有效的新型抗腫瘤藥物載體。

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