直接RT-LAMP檢測(cè)EV71方法的建立和評(píng)價(jià)

阮美生，郭龍華，周天龍，黎 榮

(1.湖北科技學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 咸寧 437100；2.深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518109）

直接RT-LAMP檢測(cè)EV71方法的建立和評(píng)價(jià)

阮美生1，郭龍華2，周天龍1，黎 榮1

(1.湖北科技學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 咸寧 437100；2.深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518109）

目的 建立并評(píng)價(jià)一種簡(jiǎn)單快速的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)-介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(直接RT-LAMP)檢測(cè)人腸道病毒71 (EV71)的實(shí)驗(yàn)方法。方法無(wú)需RNA提取，用熱處理標(biāo)本后用直接RT-LAMP方法檢測(cè)EV71，并用臨床收集的290份咽試標(biāo)本評(píng)價(jià)其靈敏度和特異性。結(jié)果直接RT-LAMP和RT-LAMP實(shí)驗(yàn)完全符合率為92.4% (268/290)，直接RT-LAMP和qRT-PCR完全符合率為88.9%。在RT-LAMP或直接RT-LAMP實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性。與RT-LAMP比較，直接RT-LAMP的靈敏度和特異性分別為90.3%和100%；與qRT-PCR比較，其敏感性和特異性分別為86.8%和100%。結(jié)論直接RT-LAMP方法能被開發(fā)成簡(jiǎn)單快速檢測(cè)EV71和其他病原體的方法。

逆轉(zhuǎn)錄環(huán)-介導(dǎo)的同溫?cái)U(kuò)增；腸道病毒71；實(shí)時(shí)定量RT-PCR；靈敏度；特異性

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是年幼兒童和嬰兒中一種常見的感染性疾病，表現(xiàn)為發(fā)熱、口腔潰瘍和手腳水泡。該疾病主要由人腸道病毒71(Human entrovirus 71，EV 71)和柯薩奇病毒A16 (Coxsackievirus A16，CVA16)引起。HFMD引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，特別是EV71的感染可導(dǎo)致嬰幼兒出現(xiàn)神經(jīng)性癥狀，甚至死亡[1-2]。EV71的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括病毒分離、病毒特異性抗體的檢測(cè)和核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)。EV71的分離培養(yǎng)需要1～2周時(shí)間，陽(yáng)性率較低。檢測(cè)EV71感染后產(chǎn)生的IgM的酶學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)已建立[3-4]，但產(chǎn)生IgM需要一定的時(shí)間，難以早期診斷。RT-PCR和實(shí)時(shí)RT-PCR實(shí)驗(yàn)已被報(bào)道用于EV71的檢測(cè)[5-8]，具有高度靈敏度，能檢出5個(gè)以上病毒RNA Copies/ml或0.1個(gè)50%組織培養(yǎng)感染性劑量(TCID50)/ml，但易產(chǎn)生假陽(yáng)性。以上這些方法需要昂貴的設(shè)備和訓(xùn)練有素的技術(shù)人員，限制了這些方法在基層醫(yī)院開展。環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。與常規(guī)PCR相比，LAMP不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，所以，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。此外，LAMP不依賴任何專門的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。

在本研究中，我們建立一種檢測(cè)EV71的直接逆轉(zhuǎn)錄的環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)方法，并用臨床標(biāo)本評(píng)價(jià)直接RT-LAMP方法的靈敏度和特異性。

1 材料與方法

1.1 病毒 6個(gè)EV71毒株(HN0803、HN0804、HN0808、AH0806、SD18和SD24)從被證實(shí)的HFMD臨床咽試或大便標(biāo)本中分離得到。EV71原型BrCr由北京生物制品所惠贈(zèng)。CVA16、CVB3和CVB5用于檢測(cè)RT-LAMP實(shí)驗(yàn)的特異性。埃可病毒購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所，所有病毒都保存在-80℃冰箱。EV71感染RD單層細(xì)胞(武漢大學(xué)典型物種保存中心)，然后在36℃孵育，直到75%～100%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。收集細(xì)胞上清，并保存在-80℃?zhèn)溆谩２《镜牡味炔捎脴?biāo)準(zhǔn)的噬斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)[9]。

1.2 臨床標(biāo)本 于2013年10月至2014年5月，本院兒科門診根據(jù)中國(guó)疾控中心HFMD診斷手冊(cè)對(duì)可疑HFMD患者收集290份臨床咽試標(biāo)本，所有這些標(biāo)本液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人RD細(xì)胞在含10%胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)有限公司)、2 mmol谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μg鏈霉素/ml的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)中37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 設(shè)計(jì)EV71-特異的RT-LAMP引物 引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[10]，腸道病毒的VP1基因被用于區(qū)別腸道病毒血清型，引物用在線軟件Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)。

1.5 RT-LAMP和qRT-PCR 除了用LoopAmp RNA擴(kuò)增試劑盒和熒光檢測(cè)試劑(FDR)(大連寶生物)RT-LAMP 參考文獻(xiàn)[11]操作。RT-LAMP反應(yīng)在Loopamp混濁儀LA-320C(Teramecs，Japan)在65℃孵育45 min。陽(yáng)性反應(yīng)定義為樣品閾值大于0.2或顏色從橘黃色改變成黃綠色。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)在ABI Real-Time System 7500 device(Applied Biosystems，USA)操作，用與RT-LAMP等量的病毒RNA的商業(yè)qRT-PCR診斷試劑盒(PCR-Fluorescence Probing)檢測(cè)EV71(金華藥業(yè)，中國(guó))。每次操作設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，采取措施阻止交叉污染。

1.6 熱處理樣品的直接RT-LAMP檢測(cè) 10 μl原始樣品和12.5 μl LoopAmp RNA擴(kuò)增反應(yīng)混合物(Eiken Chemical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)，0.5 μ l無(wú)RNase滅菌水和0.5 μl引物(F3和B3:20 pmol/ml；BIP和FIP:120 pmol/ml；Loop-1和Loop-2:60 pmol/ml)；這些混合物在水浴鍋95℃30 s，立即放在冰上2 min，然后加入1 μl混合物到反應(yīng)體系中。除了孵育時(shí)間延長(zhǎng)到75 min外，直接RT-LAMP操作同上，擴(kuò)增后加入1 μl 100培稀釋的SYBR Green I(Invitrogen，Eugene Oregon，USA)在紫外燈下裸眼觀察。顏色從橘黃色變成綠色評(píng)判為陽(yáng)性。

1.7 RT-LAMP和直接RT-LAMP的特異性和敏感性 RT-LAMP通過2 μl提取的EV71參考毒株和各種不同病毒檢測(cè)其特異性，已滴定的EV7110倍稀釋后進(jìn)行靈敏度分析，而直接的RT-LAMP用10 μl熱處理的病毒培養(yǎng)上清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 直接RT-LAMP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化 直接RT-LAMP實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞培養(yǎng)的病毒為模版確定優(yōu)化熱處理的溫度、時(shí)間、引物工作濃度以及實(shí)驗(yàn)的時(shí)間。LAMP擴(kuò)增在65℃，75 min后檢測(cè)，把1 μl被稀釋的SYBR Green I加到反應(yīng)管中，陽(yáng)性(擴(kuò)增的產(chǎn)物)變綠，所有陰性的對(duì)照仍維持原來(lái)的橘黃色，即SYBR Green I的起始顏色(圖1)。

圖1 RT-LAMP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EV71陽(yáng)性和陰性標(biāo)本在普通和紫外燈下觀察到的顏色

2.2 直接RT-LAMP與RT-LAMP和qRT-PCR方法的比較 用直接RT-LAMP檢測(cè)從疑似HFMD患者中收集290份熱處理的咽試子標(biāo)本的EV71。同時(shí)，將等量的模版RNA用于RT-LAMP和qRT-PCR。直接RT-LAMP和RT-LAMP實(shí)驗(yàn)完全符合率為92.4%(268/290)，直接RT-LAMP和qRT-PCR完全符合的為88.9%。在RT-LAMP或直接RT-LAMP實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性。與qRT-PCR比較，直接RT-LAMP和RT-LAMP的靈敏度和特異性分別為90.3%和100%、86.8%和100%。

3 討論

目前臨床實(shí)驗(yàn)室常見的EV71檢測(cè)方法有病毒分離培養(yǎng)、ELISA、放免和RT-PCR等，均需要昂貴的儀器設(shè)備和訓(xùn)練有素的技術(shù)人員，和(或)需要時(shí)間長(zhǎng)，這些方法不適合基層醫(yī)院和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)EV71。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單快速檢測(cè)EV71感染的方法將有助于EV71的早診斷。EV71 RNA提取后用RT-LAMP能快速診斷EV71的感染[12-14]。但RNA提取步驟需要約30 min，省去RNA提取能減少RNA的降解，節(jié)省時(shí)間，有利于在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)快速診斷EV71的感染。為了減少RT-LAMP檢測(cè)EV71的費(fèi)用和時(shí)間，我們探索是否能夠無(wú)需對(duì)樣品中RNA提取的處理步驟，即用直接RT-LAMP檢測(cè)EV71。在本研究中，我們采用幾種不同的裂解緩沖液可不經(jīng)過RNA提取步驟的幾個(gè)預(yù)處理方法檢測(cè)EV71。在我們的研究中，50 μl原始樣品(10個(gè)EV-71陽(yáng)性和5個(gè)EV-71陰性樣品)與100 μl裂解緩沖液A(含5%NP-40，1.5%2-巰基乙醇)，或裂解緩沖液B(含0.1 M Tris-HCl和0.05%Tween 20)，或裂解緩沖液C(含0.1 mol/L Tris-HCl，0.05%Tween 20和0.24 mg/ml蛋白酶K)。在室溫孵育15 min后，混合物在75℃水浴5 min，10 μl上清液加入到反應(yīng)混合物做RT-LAMP。與已報(bào)道的DNA病毒的直接LAMP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，如HSV病毒[15]、HHV-6[16-17]和馬皰疹病毒1[10]比較，熱處理的溫度和孵育時(shí)間需要優(yōu)化，可能因?yàn)镈NA和RNA之間熱穩(wěn)定的巨大差異，特別是RNA病毒基因組含較復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)[18]。

為了評(píng)估直接RT-LAMP的靈敏度和特異性，收集咽試標(biāo)本290份，用商業(yè)RNA提取試劑盒提取RNA，再用qRT-PCR和RT-LAMP方法檢測(cè)，比較qRT-PCR、RT-LAMP和直接RT-LAMP對(duì)這些標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果。qRT-PCR和RT-LAMP的總體符合率較好(96.5%一致率)。在258份qRT-PCR陽(yáng)性的咽試標(biāo)本中，RT-LAMP實(shí)驗(yàn)有24份陰性，直接RT-LAMP陰性66份。qRT-PCR和直接RT-LAMP的差異檢測(cè)結(jié)果是由于直接RT-LAMP的輕微不敏感性，原因如下：加入的樣品少(10 μl的原始樣品)，樣品中病毒滴度低，不同的樣品質(zhì)量(原樣品中含潛在擴(kuò)增抑制劑)。直接RT-LAMP檢測(cè)無(wú)假陽(yáng)性，在本研究中，直接RT-LAMP實(shí)驗(yàn)的臨床使用操作簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)的靈敏度和特異性上無(wú)顯著性危害。此外，在290份咽試標(biāo)本中，290份熱處理的標(biāo)本也用直接qRT-PCR檢測(cè)，與qRT-PCR比較，只有約60%的符合率，表明Bst DNA聚合酶比Taq聚合酶在原始樣品的擴(kuò)增中更耐受抑制劑的抑制。

熱處理標(biāo)本準(zhǔn)備模版的方法能取代昂貴和費(fèi)時(shí)的RNA分離方法。來(lái)自熱處理的咽試標(biāo)本直接擴(kuò)增后聯(lián)合濁度實(shí)驗(yàn)評(píng)估或用SYBR Green I直接觀察直接RT-LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物(大多數(shù)在45 min就有陽(yáng)性反應(yīng))。因此該方法能夠大量減少檢測(cè)費(fèi)用和時(shí)間，使其具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

直接RT-LAMP能檢測(cè)咽試標(biāo)本中的EV71病毒。熱處理的RT-LAMP實(shí)驗(yàn)易于操作，所以直接RT-LAMP方法能簡(jiǎn)單快速檢測(cè)EV71的感染，有助于早診斷HFMD，以控制HFMD的爆發(fā)。但在該方法用于臨床診斷EV71感染之前，需要大量不同來(lái)源的標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估。

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Development and assessment of direct reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for EV71 detection.

RUAN Mei-sheng1,GUO Long-hua2,ZHOU Tian-long1,LI Rong1.1.Department of Clinical Laboratory,the Second Affiliated Hospital,Hubei University of Science and Technology,Xianning 437100,Hubei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Shenzhen Longhua New District People's Hospital,Shenzhen 518109,Guangdong,CHINA

Objective To develop a simple and rapid direct reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(direct RT-LAMP)experimental method for detecting enterovirus 71(EV71)infection,and the sensitivity and specificity of this method using clinical nasopharyngeal swab specimens for the detection of EV71 were evaluated.MethodsDirect RT-LAMP without RNA extraction and with heat-treatment was used to detect EV71 infection in 290 nasopharyngeal swab specimens.The sensitivity and specificity were evaluated.ResultsThe accordance rate of direct RT-LAMP and RT-LAMP was 92.4%(268/290),and that of direct RT-LAMP and qRT-PCR was 88.9%.No false positive was found in direct RT-LAMP or RT-LAMP.The clinical performance demonstrated the sensitivity and specificity of direct RT-LAMP was 90.3%and 100%compared to RT-LAMP,and 86.8%and 100%compared to qRT-PCR,respectively.ConclusionDirect RT-LAMP method can potentially be developed for simple and rapid screening of EV71 and other pathogens.

Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP);Enterovirus 71 (EV71);Real-time RT-PCR;Sensitivity;Specificity

R446

A

1003—6350（2015）18—2717—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0986

2015-01-06)

深圳市寶安區(qū)科技創(chuàng)新局科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2012253）

郭龍華。E-mail：fsgm2399@126.com