MicroRNA-21促進(jìn)大鼠雪旺細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究*

寧昕杰， 王 輝△， 陸新華， 羅駿成， 巴越洋

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510630； 2中山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 中山 520483)

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MicroRNA-21促進(jìn)大鼠雪旺細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究*

寧昕杰1， 王 輝1△， 陸新華1， 羅駿成1， 巴越洋2

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510630；2中山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 中山 520483)

目的： 探討神經(jīng)損傷后microRNA-21(miR-21)促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。方法: 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)將人工合成的miR-21模擬物(mimic)及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-21的雪旺細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)分析miR-21對(duì)雪旺細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。使用Western blotting實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)蛋白(TGFBI)和cyclin D1的表達(dá)水平。結(jié)果: miR-21在損傷模型組中的表達(dá)分別為假手術(shù)組和正常神經(jīng)組織的(7.87±0.75)和(7.75±0.80)倍(P<0.01)。miR-21 mimic組miR-21的表達(dá)分別為對(duì)照組和空白組的(2.21±0.14)和(2.29±0.21)倍(P<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h后miR-21 mimic組CCK-8實(shí)驗(yàn)的A450值較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組增高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖指數(shù)高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.01)。同時(shí)與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-21后48 h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TGFBI明顯降低，cyclin D1表達(dá)增多(P<0.05)。結(jié)論: miR-21可促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與其下調(diào)TGFBI的表達(dá)有關(guān)。

微小RNA-21； 雪旺細(xì)胞； 周圍神經(jīng)損傷； 神經(jīng)再生

周圍神經(jīng)損傷后再生修復(fù)是神經(jīng)科學(xué)當(dāng)前面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一。周圍神經(jīng)損傷后，雪旺細(xì)胞(Schwann cells)作為周圍神經(jīng)再生的主體，發(fā)揮重要作用:(1)增殖并趨化巨噬細(xì)胞；(2)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及細(xì)胞外基質(zhì)；(3)與再生軸突形成縫隙連接和緊密連接[1]。這些行為在維持神經(jīng)元的存活，引導(dǎo)軸突再生，促進(jìn)神經(jīng)損傷后再生修復(fù)中扮演重要角色。MicroRNA(miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，幾乎參與了包括生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、疾病及死亡等所有的生物學(xué)過(guò)程[2]。研究表明，microRNA-21(miR-21)在周圍神經(jīng)損傷后高表達(dá)，是潛在的神經(jīng)損傷修復(fù)的治療靶點(diǎn)。但miR-21參與周圍神經(jīng)損傷后再生修復(fù)的機(jī)制尚不明確。因此，本文研究過(guò)表達(dá)miR-21對(duì)雪旺細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白含量的影響，進(jìn)一步探討miR-21在周圍神經(jīng)損傷后再生修復(fù)過(guò)程中的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

24只重150 g實(shí)驗(yàn)用SD大鼠由中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)得；RSC96雪旺細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(HyClone)；RNA 抽提試劑(TaKaRa)；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；SYBR Green Real time PCR Mix (Roche)；CCK-8試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司)。miR-21類似物(mimic)及無(wú)意義序列(control miRNA)由Invitrogen合成。

2 主要方法

2.1 神經(jīng)損傷模型建立 將24只成年SD大鼠隨機(jī)分為神經(jīng)損傷組、假手術(shù)組和正常對(duì)照組。靜脈復(fù)合麻醉，左下肢做縱切口，逐層分離，暴露坐骨神經(jīng)上段，損傷模型組分離外膜后完全橫斷坐骨神經(jīng)后逐層縫合組織，假手術(shù)組逐層暴露坐骨神經(jīng)后縫合組織，正常對(duì)照組不做處理。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) RSC96細(xì)胞在含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、 5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RSC96 細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前 24 h 接種于 6 孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá) 80% 融合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，按照操作說(shuō)明將miR-mimic和control miRNA轉(zhuǎn)染入RSC96細(xì)胞中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

2.4 RNA提取 分別將實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及正常對(duì)照組組織剪碎，加入1 mL Trizol，冰上勻漿，轉(zhuǎn)入一新EP管中，室溫保存5 min，加氯仿0.2 mL，振蕩混合，室溫放置5 min，10 000 r/min 4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相(吸70%)到一新EP管中，加異丙醇0.5 mL，振蕩混合，室溫保存10 min，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，倒掉上清，加1 mL 75%無(wú)水乙醇(4 ℃保存)，振蕩混合，10 000 r/min 4 ℃離心5 min，倒掉上清，室溫或37 ℃放置20 min，使RNA沉淀干燥。加20 μL DEPC水至EP管中，在60 ℃孵育3～5 min，使RNA充分溶解，測(cè)定RNA濃度。

2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR PCR條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，采用U6作為內(nèi)參照，3次獨(dú)立樣本經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)，通過(guò)比較 Ct值進(jìn)行相對(duì)定量分析。miR-21和U6相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄引物[3]以及 PCR 引物見表1。

表1 MicroRNA-21及U6的引物序列

2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以每孔3000個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板，每組細(xì)胞設(shè)5個(gè)平行孔，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)24～96 h，每孔加入5 g/L的CCK-8 20 μL，繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm處各孔吸光度(A)值[4]。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次。加入預(yù)冷95%乙醇，于4 ℃固定過(guò)夜。離心收集細(xì)胞，以1 mL的PBS洗細(xì)胞1次，加入500 μL PBS(含50 mg/L溴化乙錠、100 mg/L RNase A和0.2% Triton X-100，4 ℃避光孵育30 min。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)數(shù)3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析，按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index, PI)，以衡量細(xì)胞的分裂活動(dòng)，PI=(S+G2/M)/(Go/G1+S+G2/M)。

2.8 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集待檢測(cè)細(xì)胞，提取總蛋白，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，將膜放在含5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入用TBST 1∶1 000稀釋的鼠抗鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)蛋白(transforming growth factor β-induced protein, TGFBI)單克隆抗體和鼠抗鼠cyclin D1單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜孵育，TBST緩沖液洗膜3次，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗鼠IgG抗體，在室溫下孵育1 h將膜洗滌后，用ECL加蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)系統(tǒng)分析(Amersham)，以β-actin作為內(nèi)參照[5]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，運(yùn)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間數(shù)據(jù)的差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RNA抽提

以相應(yīng)溶劑為空白對(duì)照，取2 μL RNA溶液于紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，觀察A260/A280及連續(xù)波長(zhǎng)吸收峰，并計(jì)算 RNA 溶液濃度，正常外周神經(jīng)組織和 RSC96細(xì)胞系總RNA 的A260/A280介于 2.0～2.3，表明RNA提取的質(zhì)量可以滿足后續(xù)real-time PCR 所需[6]。

2 miR-21 在損傷模型組神經(jīng)組織中的表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-21在損傷模型組中的表達(dá)，分別為假手術(shù)組和正常神經(jīng)組織的(7.87±0.75)倍和(7.75±0.80)倍，明顯高于假手術(shù)組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.miR-21 expression was higher in injury group than that in control groups. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs other 2 groups.

轉(zhuǎn)染miR-21mimic和control miRNA入RSC96細(xì)胞系，使用real-time PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-21 mimic組miR-21的表達(dá)分別為對(duì)照組和空白組的(2.21±0．14)倍和(2.29±0.21)倍，明顯高于其它2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.Change of miR-21 expression after transfection. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs other 2 groups.

3 miR-21 對(duì)雪旺細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染miR-21 mimic的雪旺細(xì)胞48 h后，實(shí)驗(yàn)組A450值與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)轉(zhuǎn)染miR-21 mimic的雪旺細(xì)胞96 h后，實(shí)驗(yàn)組A450值與轉(zhuǎn)染對(duì)照組和正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The effect of miR-21 on Schwann cell proliferation. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs other 2 groups.

4 miR-21對(duì)雪旺細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-21 mimic實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖指數(shù)高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，見圖4。

5 miR-21對(duì)TGFBI和cyclin D1蛋白表達(dá)水平的影響

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-21 mimic組細(xì)胞中TGFBI蛋白表達(dá)水平明顯低于其它2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而實(shí)驗(yàn)組內(nèi)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1表達(dá)高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，見圖5。

Figure 4.The effect of miR-21 transfection on the cell cycle of Schwann cells detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs other 2 groups.

Figure 5.TGFBI and cyclin D1 protein levels in Schwann cells after transfection of miR-21 mimic detected by Western blotting. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs other 2 groups.

討 論

周圍神經(jīng)損傷是我國(guó)多發(fā)性疾病之一，每年因外傷、醫(yī)療損傷等導(dǎo)致的神經(jīng)損傷約100萬(wàn)人，神經(jīng)功能缺失嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量。目前在臨床上主要有自體神經(jīng)移植、人工合成神經(jīng)等治療手段，盡管可以部分恢復(fù)受損神經(jīng)功能，但是都未能取得令人滿意的結(jié)果。在神經(jīng)再生修復(fù)的過(guò)程中，雪旺細(xì)胞的增殖能力、存活數(shù)量、凋亡比例是周圍神經(jīng)再生的決定性因素。然而，多數(shù)情況下，受損部位雪旺細(xì)胞的增殖分化與細(xì)胞數(shù)量無(wú)法支持受損神經(jīng)完成再生，結(jié)果形成疤痕。因而尋找調(diào)控雪旺細(xì)胞增殖的新機(jī)制成為周圍神經(jīng)修復(fù)再生領(lǐng)域研究的重要問(wèn)題[7]。

近年來(lái)的研究表明，miRNAs在受損神經(jīng)的雪旺細(xì)胞中表達(dá)異常，導(dǎo)致多個(gè)基因的表達(dá)變化，從而調(diào)控雪旺細(xì)胞的分化、分泌等生物學(xué)行為[8]。Yu等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)損傷后，大鼠神經(jīng)組織中miR-21、miR-221等miRNAs表達(dá)特異性升高；Strickland等[11]實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)miRNA-21具有調(diào)控大鼠背根神經(jīng)元促軸突再生的作用。在本研究中，我們用人工合成的miR-21寡聚核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細(xì)胞RSC96，旨在揭示miR-21對(duì)雪旺細(xì)胞的生物學(xué)作用。經(jīng)CCK-8方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-21實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染后48和96 h的細(xì)胞增殖較其它各對(duì)照組均有顯著上升，說(shuō)明雪旺細(xì)胞的增殖活力受到miR-21的影響而提高。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，miR-21實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期分布在轉(zhuǎn)染后48 h發(fā)生改變，處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例增多，細(xì)胞增殖指數(shù)增多，說(shuō)明miR-21的轉(zhuǎn)染引起了雪旺細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。由此可以得出，miR-21參與雪旺細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期調(diào)控。

TGFBI是由Skonier等[12]于1992年從人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是miR-21潛在的靶基因之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，與細(xì)胞的損傷修復(fù)、形態(tài)形成密切相關(guān)。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1是目前公認(rèn)的調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子，正性調(diào)控細(xì)胞周期G1/S關(guān)卡。已有的研究表明，cyclin D1基因的表達(dá)受到TGFBI的調(diào)控[13]。并通過(guò)傳導(dǎo)生長(zhǎng)因子信號(hào)刺激可引起下游一系列級(jí)聯(lián)調(diào)控，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Western blotting灰度值分析后，顯示TGFBI在miR-21實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)低于對(duì)照組，cyclin D1蛋白在miR-21實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)明顯高于對(duì)照組。這提示miR-21靶定TGFBI并調(diào)控cyclin D1表達(dá)，加速細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖[14]。

雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的重要支持細(xì)胞，缺乏足夠的雪旺細(xì)胞是制約神經(jīng)再生修復(fù)的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究證實(shí)，神經(jīng)損傷后miR-21在雪旺細(xì)胞中高表達(dá)，并通過(guò)靶基因TGFBI介導(dǎo)cyclin D1的表達(dá)，調(diào)控雪旺細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，揭示了神經(jīng)損傷后雪旺細(xì)胞增殖的新機(jī)制，為治療周圍神經(jīng)損傷提供新的思路。

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MicroPNA-21 promotes proliferation of rat Schwann cells following nerve injury

NING Xin-jie1, WANG Hui1, LU Xin-hua1, LUO Jun-cheng1, BA Yue-yang2

(1DepartmentofNeurosurgery,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2DepartmentofNeurosurgery,ZhongshanPeople’sHospital,Zhongshan520483,China.E-mail:doctorwanghui@126.com)

AIM: To investigate the molecular mechanism of microRNA-21 (miR-21) in the regulation of Schwann cell proliferation following nerve injury. METHODS: The expression of miR-2l was detected by real-time PCR. Synthetic miR-21 mimic and its control were transfected into rat Schwann cells. CCK-8 assay was performed to evaluate the influence of miR-21 on the proliferation of Schwann cells. The cell cycle distribution was determined by flow cytometry. The expression of transforming growth factor β-induced protein (TGFBI) and cyclin D1 were detected by Western blotting. RESULTS: The expression of miR-21 in model group was 7.87±0.75 and 7.75±0.80 times higher than that in sham operation group and blank group respectively. After transfected with miR-21 mimic, the expression of miR-21 in experimental group was 2.21±0.14 and 2.29±0.21 times higher than that in negative control group and blank group respectively. Moreover, theA450value of CCK-8 assay in experimental group at 48 h was higher than that in negative control group and blank group. The proliferation index in experimental group was higher than that in negative control group and blank group. At the same time, the expression of TGFBI obviously decreased and the cyclin D1 increased in the Schwann cells 48 h after transfection with miR-21. CONCLUSION: miR-21 promotes the proliferation activity of Schwann cells by down-regulating TGFBI expression．

MicroRNA-21; Schwann cells; Peripheral nerve injury; Nerve regeneration

1000- 4718(2015)03- 0392- 05

2014- 10- 22

2014- 12- 05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30901542)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 7301217)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. B2007061)；廣東省科技計(jì)劃(No. 2012B031800056)；中山大學(xué)高校基本業(yè)務(wù)費(fèi)青年教師培育資助項(xiàng)目(No. 12ykpy44)

△通訊作者 Tel： 020-85252170； E-mail： doctorwanghui@126.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.002