糖尿病大鼠背根神經節JNK的表達水平對足部皮膚組織學變化的影響*

倪桂蓮， 崔 融， 陳干明， 吳仲敏

(臨海市第一人民醫院 1神經內科， 2內分泌科，浙江 臨海 317000； 3臺州學院醫學院人體解剖學教研室，浙江 臺州 318000)

?

糖尿病大鼠背根神經節JNK的表達水平對足部皮膚組織學變化的影響*

倪桂蓮1， 崔 融1， 陳干明2， 吳仲敏3△

(臨海市第一人民醫院1神經內科，2內分泌科，浙江 臨海 317000；3臺州學院醫學院人體解剖學教研室，浙江 臺州 318000)

目的： 觀察糖尿病(DM)大鼠皮膚組織學改變，探討背根神經節(DRG)內c-Jun氨基端激酶(JNK)蛋白在其中的可能作用機制。方法: 雄性SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素制備DM模型，分別取正常對照(control)組、DM 2周(DM2)組、DM 4周(DM4)組和DM 8周(DM8)組大鼠足底皮膚標本進行PGP 9.5免疫組化染色和HE染色，觀察皮膚PGP 9.5免疫陽性神經末梢和皮膚組織結構變化；同時采用Western blotting法分別檢測上述各組大鼠足底皮膚組織內PGP 9.5蛋白和脊髓腰5～6(L5，6)、骶1(S1)節段DRG內JNK和p-JNK蛋白的表達。結果: 大鼠足底皮膚PGP 9.5免疫陽性神經末梢主要分布于表皮基底層和真皮乳頭層，與正常對照組比較，DM4組大鼠表皮陽性神經末梢密度減少，分布稀疏，DM8組大鼠表皮陽性神經末梢分布明顯減少，神經直徑變細，長度變短，走形扭曲；組織學觀察可見，DM4組大鼠表皮組織變薄，表皮細胞層次減少，細胞分布及排列不均勻，DM8組大鼠表皮細胞層次明顯減少，細胞腫脹模糊，細胞間隙增大，部分表皮缺乏復層排列， 真皮層膠原纖維萎縮、變性，皮下脂肪明顯減少。蛋白印跡檢測發現皮膚組織內PGP 9.5蛋白的表達隨病程呈漸進性減弱；同時L5，6-DRG和S1-DRG內p-JNK蛋白的水平呈現漸進性增強趨勢。DM大鼠皮膚PGP 9.5免疫陽性神經末梢吸光度值與L5，6-DRG和S1-DRG內的p-JNK蛋白灰度值之間呈負相關(P<0.01)；與表皮厚度值之間呈顯著正相關。結論: DM大鼠皮膚組織和皮膚神經均存在明顯形態結構改變，同時存在L5，6-DRG和S1-DRG內p-JNK蛋白的漸進性高表達，DM大鼠皮膚PGP 9.5免疫陽性神經末梢密度變化與L5，6-DRG和S1-DRG內p-JNK蛋白水平的變化之間呈負相關；與表皮厚度的變化呈顯著正相關。皮膚神經形態結構的改變可能與背根神經節細胞JNK/SAPK通路活化有關，阻斷或抑制JNK/SAPK通路可以起到延緩糖尿病周圍神經病變，減輕皮膚組織病變發生的作用。

背根神經節； c-Jun氨基端激酶； 糖尿??； 皮膚組織； 皮膚神經

糖尿病(diabetes mellitus，DM)的并發癥是引起糖尿病患者致死、致殘的主要原因，在各種糖尿病誘發的并發癥中，末梢神經病變和皮膚病變的發病率非常高。據有關資料顯示，約50%的糖尿病患者出現末梢神經病變[1-2]。而糖尿病患者罹患皮膚病的比例達30%[3]，末梢神經病變是肢體保護性的機械性感覺喪失、創傷性潰瘍損傷并因此截肢的主要原因。皮膚病變可加重糖尿病病情，甚至導致十分嚴重的后果[4]。因此，研究糖尿病早期皮膚組織和神經的病變特點，并予以早期治療干預，對于防治糖尿病并發癥和提高患者生活質量有著重要的意義。

本研究采用鏈脲佐菌素腹腔注射制備糖尿病大鼠模型，采用PGP 9.5免疫組化染色和HE染色方法觀察實驗大鼠足底皮膚神經和皮膚組織形態結構的變化，并通過檢測大鼠足底皮膚組織內PGP 9.5蛋白及對應的腰5、6(lumbar 5,6,L5,6)背根神經節(dorsal root ganglia, DRG)和骶1(sacral 1,S1)-DRG內c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p-JNK蛋白的表達變化，探討背根神經節JNK活化對糖尿病大鼠皮膚組織和皮膚神經形態結構的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

鏈脲佐菌素(Sigma)，臨用前用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.5，4 ℃配制成2%溶液；兔抗PGP 9.5抗體(Santa Cruz)；兔抗JNK和p-JNK抗體(Sigma)；SP免疫組化染色試劑盒(福州邁新公司)。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠模型的建立及分組 雄性SD大鼠60只，體重(200±20)g，購自浙江省實驗動物中心；適應性喂養1周，取尾靜脈血0.1 mL，測定隨機血糖后，大鼠按隨機數字表隨機分為正常對照組(control組，30只)和DM模型組(DM組，30只)。大鼠造模前禁食至少12 h，DM組大鼠按55 mg/kg一次性腹腔注射鏈脲佐菌素，control組則注射等體積檸檬酸鈉緩沖液，1周后尾靜脈采血測定血糖，同時監測體重，若誘導前血糖水平<6 mmol/L，誘導后血糖水平>11.2 mmol/L，隨機抽樣的胰腺組織學觀察證實胰島細胞被破壞，即可視為糖尿病模型誘導成功。再將造模成功后的大鼠按飼養時間隨機分為2周組(DM2)、4周組(DM4)和8周組(DM8)，每組10只。實驗期間全部大鼠予普通飼料喂養，自由進食和水。

2.2 足部皮膚組織HE染色 在造模成功后的第2、4、8周，分別隨機取control組和DM組大鼠各5只經腹腔注射1%戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉，4%多聚甲醛灌注固定后，隨機選取足底皮膚全層組織，按常規方法作HE染色，觀察皮膚全層厚度、表皮細胞層次、排列和結構的變化。采用C5 型目鏡測微尺(上海第三光學儀器廠)測量表皮厚度，每個活檢標本有5張切片參加測量，每張切片在3個顯微鏡視野下進行觀察，最后取其平均值，表皮厚度以表皮-真皮交界處與顆粒細胞層最外層之間的垂直距離表示[5]。

2.3 足部皮膚組織內PGP 9.5免疫組化染色 上述各組大鼠多聚甲醛灌注固定后，隨機選取1 cm×1 cm左右的足底全層皮膚做連續冰凍切片，切片角度為垂直皮膚表面，常規方法進行PGP 9.5免疫組化染色。切片分為2套，其中1套在呈色后進行蘇木素復染，另1套不復染。所有切片經自然干燥后常規脫水，透明，封片。Nikon顯微鏡下觀察并攝片。陰性對照切片用PBS液替代I抗，其余實驗步驟不變。取無復染的圖片做顯微圖像分析(采用OPTIMAS 6.5 圖像分析軟件)，得出各組大鼠足底皮膚內PGP 9.5陽性神經末梢的圖像吸光度(A)值。

2.4 足部皮膚組織內PGP 9.5蛋白和背根神經節內JNK和p-JNK蛋白的檢測 在造模成功后的第2、4、8周，分別隨機取control組和DM組大鼠各5只經腹腔注射1%戊巴比妥鈉60 mg/kg深麻醉后，隨機選取足底皮膚全層組織以及L5，6-DRG、S1-DRG，冰浴中分別抽提總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。分別取20 μg蛋白進行10% SDS-PAGE并轉膜。5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入目標蛋白I抗(1∶1 000)或β-actin I抗(1∶500)，4 ℃反應過夜。次日洗膜，加入1∶1 000辣根過氧化物酶標記的II抗，室溫孵育1 h，洗膜后加ECL顯色劑，X片顯影，所得結果以β-actin為內參照，用Quantity One 軟件對反應條帶進行半定量分析，記錄所測的灰度值，并以和同組β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

3 統計學處理

各組數據以均數±標準差(mean±SD)表示，統計處理用SPSS 17.0軟件進行分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 正常對照組、糖尿病模型組大鼠體重、血糖變化

造模前2組大鼠體重無明顯差異，造模后大鼠每日飲水、飲食以及尿量顯著增多，體重下降，DM組大鼠體重增長緩慢，與control組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。造模后糖尿病大鼠血糖明顯升高，與control組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表1 大鼠體重的變化

**P<0.01vscontrol group.

表2 大鼠血糖的變化

**P<0.01vscontrol group.

2 足部皮膚PGP 9.5免疫陽性神經末梢形態分布變化

如圖1所示，大鼠足底皮膚PGP 9.5免疫陽性神經末梢主要分布于表皮基底層和真皮乳頭層，呈樹枝狀或念珠狀分布，大多成束走行，長短不一，有的呈結節狀膨大。PGP 9.5免疫組化圖像A值測定結果表明，DM組PGP 9.5免疫陽性神經末梢分布密度隨病程推移呈現進行性下降趨勢，與同時期C組比較差異有統計學意義(P<0.01)； 各時點control組的PGP 9.5免疫陽性神經末梢分布密度差異無統計學意義，各時點DM組對應值差異有統計學意義(P<0.01)，進一步做LSD兩兩比較發現，DM8組明顯低于DM2組(P<0.01)和DM4組(P<0.05)，見表3。

Figure 1.Distribution of PGP 9.5 immunoreactive nerve terminals in the plantar skin of rats (HE counterstaining, ×400).

表3 大鼠足底皮膚PGP 9.5免疫組化圖像吸光度(A)值的變化

**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsDM2 group;#P<0.05vsDM4 group.

3 足部皮膚組織內PGP 9.5蛋白表達變化

如圖2所示，與同時點control組比較，DM各組大鼠足底皮膚組織內PGP 9.5蛋白表達呈進行性減弱，PGP 9.5蛋白表達的變化趨勢與足底皮膚PGP 9.5免疫陽性神經末梢密度變化趨勢相吻合。

Figure 2.The changes of PGP 9.5 expression in the plantar skin of the rats. Mean±SD. n=5. ** P<0.01 vs control group; △△P<0.01 vs DM2 group; ##P<0.01 vs DM4 group.

4 足部皮膚厚度和組織結構變化

DM大鼠表皮厚度較同時期C組明顯變薄(P<0.01),control組各時點表皮厚度無明顯差異，DM組表皮厚度隨著病程延長而變薄，各時點間差異有統計學意義(P<0.01)，進一步作LSD兩兩比較發現，DM8組明顯低于DM2組和DM4組(P<0.01)，見表4。如圖3所示，DM4組大鼠表皮組織變薄，表皮細胞層次減少，DM8組大鼠表皮組織明顯變薄，表皮細胞層次明顯減少，細胞腫脹模糊，細胞間隙增大，且部分表皮缺乏復層排列，真皮層膠原纖維萎縮、變性，皮下脂肪明顯減少。

Figure 3.The changes of the plantar skin epidermal thickness and cell morphology in the rats (HE staining, ×200).

表4 大鼠足底皮膚厚度值的變化

**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsDM2 group;##P<0.01vsDM4 group.

5 背根神經節內JNK和p-JNK蛋白表達變化

如圖4所示，與同時點C組比較，DM各組大鼠L5，6-DRG和S1-DRG內p-JNK水平呈漸進性增強，p-JNK/JNK比值不斷增高，差異有統計學意義(P<0.01)；DM組各時點p-JNK水平的差異有統計學意義(P<0.01)，進一步LSD兩兩比較發現，DM8組大鼠p-JNK的水平明顯高于DM2組與DM4組(P<0.01)，見表5。

表5 大鼠背根神經節JNK和p-JNK蛋白水平的變化

**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsDM2 group;##P<0.01vsDM4 group.

Figure 4.The changes of JNK and p-JNK protein levels in L5-DRG, L6-DRG and S1-DRG of the rats.

6 足部皮膚神經密度、皮膚厚度和背根神經節內p-JNK蛋白表達的相關性分析

Spearman相關分析顯示，DM大鼠皮膚PGP 9.5免疫陽性神經末梢密度與皮膚表皮厚度(P<0.01)之間呈顯著正相關(圖5)，與L5，6-DRG、S1-DRG內p-JNK(P<0.01)蛋白水平之間呈負相關(圖6)。

Figure 5.Correlation between the absorbance of the PGP 9.5 and epidermal thickness of the plantar skin in DM group after injection of streptozotocin.

Figure 6.Correlation between the absorbance of the PGP 9.5 and gray level of the p-JNK in DM group after injection of streptozotocin.

討 論

眾所周知，糖尿病本身并不可怕，可怕的是伴隨而來的各類并發癥，在糖尿病誘發的并發癥中，以末梢神經病變和皮膚病變最為常見。糖尿病患者出現皮膚感覺功能障礙常常誘發肢體的慢性潰瘍，造成臨床治療中許多患者難以愈合，最終不得不截肢。因此，針對糖尿病皮膚神經和皮膚組織病變關系及其機制的研究越來越受到人們的重視[6]。既往研究認為皮膚神經損害是糖尿病皮膚病變等慢性并發癥發生的機理之一。研究發現糖尿病大鼠表皮厚度變化與皮膚神經病變相關[7-8]。支配皮膚(包括表皮)的神經纖維源于背根神經節，主要C類和Aa纖維，皮膚神經通過釋放神經肽等參與皮膚完整性的保持和修復，外周神經損害可伴發皮膚營養機能和愈合能力改變導致皮膚潰瘍和壞死。本研究發現，糖尿病大鼠足底皮膚神經的分布密度與正常對照組相比明顯減少，皮膚神經分布密度減少的同時伴隨著皮膚表皮厚度的變薄以及皮膚組織結構的改變，兩者之間存在顯著正相關，提示皮膚神經病變與皮膚組織結構改變之間有一定的內在聯系。

關于糖尿病皮膚神經病變的發病機制至今尚未完全闡明，一般認為與糖尿病引起的皮膚神經結構和功能障礙有關。胰島素缺乏和高血糖是始動因素，神經缺血、多元醇通路活性增高、神經營養因子減少、自身免疫等共同參與其發病過程。有研究報道，大鼠L5脊神經結扎后能誘導L5-DRG中JNK的激活，且主要位于小型的C纖維神經元中；在L5-DRG中注射JNK抑制劑D-JNKI-1能阻止卻不能逆轉SNL引起的觸誘發痛；提示DRG中JNK的激活在神經性疼痛的產生和維持中擔任重要角色[9-10]。我們在前期的實驗中發現，糖尿病性神經痛大鼠背根神經節內p-JNK免疫陽性神經元明顯增多，提示糖尿病大鼠皮膚痛覺過敏可能與背根神經節相關神經元JNK的激活有關[11]。

JNK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，通過信號級聯使底物磷酸化，從而調節細胞功能。當細胞受到刺激時，JNK信號通路可被不同的受體激活，調節細胞的發育、分化、凋亡等，大量研究顯示其活化與神經病理性疼痛的發生發展有關[12]。本研究發現，隨著糖尿病病程的延長，糖尿病大鼠皮膚神經、表皮厚度和皮膚組織結構出現漸進性病理改變，同時存在初級感覺神經元p-JNK蛋白表達的進行性增強。相關性分析顯示，糖尿病大鼠皮膚PGP 9.5免疫陽性神經末梢分布密度與L5，6-DRG、S1-DRG內p-JNK的水平變化呈負相關；與表皮厚度的變化呈顯著正相關。我們認為，背根神經節JNK活化與糖尿病大鼠皮膚神經和皮膚組織病變有關。

綜上所述，糖尿病大鼠足底皮膚神經的分布密度明顯減少，神經直徑變細，長度變短，走行扭曲，同時皮膚表皮厚度明顯變薄，表皮細胞層次明顯減少，表皮細胞腫脹模糊，細胞間隙增大，真皮層膠原纖維萎縮、變性，皮下脂肪進行性減少，相關性分析顯示，糖尿病大鼠皮膚神經末梢分布密度變化與表皮厚度變化之間呈顯著正相關，提示皮膚神經病變和皮膚組織結構改變之間存在密切關系。本研究同時發現，支配足底皮膚的腰骶段背根神經節內p-JNK蛋白的水平呈現進行性增加，且背根神經節內p-JNK蛋白水平的變化與大鼠足底皮膚組織內PGP 9.5陽性神經末梢的分布密度變化呈負相關，提示背根神經節JNK活化與糖尿病大鼠皮膚神經病變有關，阻斷或抑制JNK/SAPK通路可以起到延緩糖尿病周圍神經病變，進而減輕皮膚組織病變發生作用。具體作用機制有待進一步探討。

[1] 侯瑞芳，湯正義，寧 光．糖尿病周圍神經病變的檢查方法及其診斷效率[J]．國際內分泌代謝雜志，2006，26(4)：270-272．

[2] 徐迎勝，鄭菊陽，張 朔，等．糖尿病周圍神經病的小纖維損害[J]．中國神經精神疾病雜志，2008，34(10)：591-593．

[3] 侯麥花,朱文元.糖尿病與皮膚病[J].臨床皮膚科雜志，2006, 35(2):122-124.

[4] 朱 平，嚴 勵，陳黎紅，等．MMP-9/MMP-1表達在糖尿病鼠皮膚傷口愈合過程中的變化及意義初探[J]．中國病理生理雜志，2008，24(11)：2204-2208．

[5] 凌 麗，江新梅，薛金偉，等．糖尿病患者表皮厚度和汗腺神經分布的變化[J]．中國老年學雜志，2009，29(4)：455-457．

[6] Jong CW, Sang SK, Kyung SK, et al. Current status of diabetic peripheral neuropathy in Korea: report of a hospital-based study of type 2 diabetic patients in Korea by the Diabetic Neuropathy Study Group of the Korean Diabetes Association[J]. Diabetes Metab J, 2014, 38(1):25-31.

[7] 林煒棟，陸樹良，陳向芳，等．糖尿病大鼠皮膚的組織化學改變[J]．中國病理生理雜志，2005，21(2)：230-233．

[8] 王 琳，李國鋒，胡文軍，等．糖尿病大鼠皮膚的組織學改變及其對糖皮質激素藥物經皮吸收的影響[J]．藥學學報，2010，45(1)：114-119．

[9] Middlemas A, Delcmix JD, Sayers NM, et al. Enhanced activation of axonaly transported stress-activated protein kinases in peripheral nerve in diabetic neuropathy is prevented neurotrophin-3[J]. Brain, 2003, 126(7):1671-1682.

[10]Zhuang ZY, Wen YR, Zhang DR, et al. A peptide c-Jun N-terminal kinase (JNK) inhibitor blocks mechanical allodynia after spinal nerve ligation: respective roles of JNK activation in primary sensory neurons and spinal astrocytes for neuropathic development and maintenance[J]. J Neurosci, 2006, 26(13):3551-3560.

[11]馮熒娣，倪桂蓮，汪利瓊，等．加巴噴丁對糖尿病性神經痛大鼠機械痛敏和背根神經節神經元JNK及p-JNK表達的影響[J]．醫學研究雜志，2013，42(10)：68-72．

[12]吳 艷，俞陳陳，曹 紅．內質網應激蛋白BiP在姜黃素抗2型糖尿病神經病理性疼痛大鼠的作用[J]．中國病理生理雜志，2012，28(10)：1796-1801．

Effect of JNK expression in dorsal root ganglia on histological change of foot skin in diabetic rats

NI Gui-lian1, CUI Rong1, CHEN Gan-ming2, WU Zhong-min3

(1DepartmentofNeurology,2DepartmentofEndocrinology,FirstPeople’sHospitalofLinhaiCity,Linhai317000,China;3DepartmentofAnatomy,TaizhouUniversitySchoolofMedicine,Taizhou318000,China.E-mail:wzmbest@163.com)

AIM: To observe the change of skin histology in diabetic rats and to investigate the possible me-chanism of c-Jun N-terminal kinase (JNK) protein in the dorsal root ganglion (DRG) during the process. METHODS: Diabetic animal model was established in the male SD rats by intraperitoneal injection of streptozotocin. Plantar skin specimens of the rats were collected from control group, DM 2-week group (DM2), DM 4-week group (DM4), and DM 8-week group (DM8). Immunohistochemical staining and HE staining were used to observe the change of PGP 9.5 immunoreactive nerve terminals and the structures of the skin tissues. The protein expression of PGP 9.5 in the plantar skin tissues, and JNK and p-JNK protein in the DRG within lumbar 5, 6 (L5, 6), and sacral 1 (S1) spinal cord segments were detected by Western blotting. RESULTS: PGP 9.5 immunoreactive nerve terminals of the plantar skin of the rats mainly distributed in the basal layer of the epidermis and papillary dermis. Compared with control group, PGP 9.5 positive nerve terminals in DM4 group showed reduced density and sparse distribution. PGP 9.5 positive nerve terminals in DM8 group showed significantly reduced distribution, thinner nerve diameter, shorter length and distorted shape. Histological changes of the thinner epidermal tissue, reduced epidermal cell layers, uneven cell distribution and arrangement in DM4 group, and significantly reduced epidermal cell layers, swollen and blurred cells, increasing cell gap, lack of stratified epidermis arrangement for part of epidermis, atropal and degenerated dermal collagen fiber, significantly decreased subcutaneous fat in DM8 group were observed. The results of Western blotting showed that the protein expression of PGP 9.5 in the plantar skin tissue of DM rats was progressively decreased along with the disease, while the protein level of p-JNK in L5, 6-DRG or S1-DRG showed a gradual increasing trend. PGP 9.5 immunoreactive positive nerve terminal density of plantar skin in DM rats had a negative correlation with the protein level of p-JNK in L5, 6-DRG and S1-DRG (P<0.01), but showed a significant positive correlation with the plantar skin thickness (P<0.01). CONCLUSION: The protein level of p-JNK within L5, 6-DRG or S1-DRG in DM rats shows a progressive enhancement. At the same time, there is a significant change in the skin tissue density and structure. The changes of skin tissue and nerve morphology in DM rat may be related to the activation of JNK/SAPK pathway in L5, 6-DRG or S1-DRG cells. Blocking or inhibiting JNK/SAPK pathway may delay the diabetic peripheral neuropathy and reduce the risk of skin lesions.

Dorsal root ganglia; c-Jun N-terminal kinase; Diabetes mellitus; Skin tissue; Skin nerve

1000- 4718(2015)03- 0415- 06

2014- 09- 15

2015- 01- 08

浙江省醫學會臨床科研基金(No. 2012ZYC-A101); 臺州市科技局科研基金(No. 1301ky53); 臨海市科技局科研基金(No. 12N12)

△通訊作者 Tel: 0576-88665198; E-mail: wzmbest@163.com

R587.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.006