阿爾茨海默病患者尿液細胞向誘導多能干細胞及神經細胞的誘導轉化*

韋 睿， 李 中， 蔡秀娟， 何 露， 雷清鋒

(1中山大學附屬第六醫院神經科，廣東 廣州 510655； 2中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院，廣東 廣州 510530)

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阿爾茨海默病患者尿液細胞向誘導多能干細胞及神經細胞的誘導轉化*

韋 睿1,2， 李 中1△， 蔡秀娟2， 何 露1， 雷清鋒1

(1中山大學附屬第六醫院神經科，廣東 廣州 510655；2中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院，廣東 廣州 510530)

目的： 獲得阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)患者來源的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。方法: 選取3例臨床診斷明確的AD病例，收集病人尿液，分離出尿路上皮細胞，對所得細胞進行原代培養。利用電轉染的方法將帶有Oct4、Sox2、Klf4和SV40LT的質粒導入原代細胞內，將其重編程為iPS細胞。隨后利用雙向抑制Smad通路的方式繼續誘導其神經分化。結果: AD病人尿液來源的細胞(以下稱為尿液細胞)均成功誘導成iPS細胞，其誘導效率與正常人來源的細胞無明顯差異。且病人的iPS細胞可成功分化為神經細胞，分化效率亦與正常人來源細胞相近。結論: 阿爾茨海默癥患者來源的尿液細胞可重編程為iPS細胞，所得到的iPS細胞可成功分化成有功能的神經元以及神經膠質細胞。

阿爾茨海默病； 誘導多能干細胞； 神經分化

隨著老齡化社會的到來，阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的發病率逐年增高，但迄今為止AD的病因與致病機制仍不明，治療方面也無重大突破。散發性AD(sporadic AD，sAD)，占AD發病人數的90%以上，雖有一定的家族聚集傾向，但其發病無法歸咎于某個特定基因的異常。截至2009年，人們通過全基因組關聯分析(genome-wide association study，GWAS)共發現20多個sAD相關基因[1]，但這些基因如何致病仍然不清楚。目前sAD的發病被歸結于遺傳與環境等多因素作用的結果。

2006年底，誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)技術由日本學者Takahashi等[2]首次在Cell雜志上發表，在生物及醫學界引起了巨大轟動。由于iPSCs能夠攜帶某些疾病患者特異性基因，并且有向各種組織分化的潛能，因此很快被廣泛用于建造包括AD在內的多種疾病模型[3-6]。2012年，Israel等[7]同時用2例淀粉樣蛋白前體基因突變的家族性AD(familial AD, FAD)患者及2例sAD患者來源的iPS細胞分化成為神經細胞，FAD檢測出了與其基因突變相一致的病理表型，包括Aβ、p-tau的高表達等。有意思的是，2例sAD患者中有1例也出現了與FAD一致的表型，而這例病人并沒有任何FAD相關的基因異常。2013年，Kondo等[8]也在1例sAD患者iPSCs分化來源的神經細胞中發現了AD相關病理表型——Aβ寡聚體升高。這些發現提示在sAD患者的基因組中，或許還存在著某些未知的致病因素導致了與FAD類似的病理過程，有待我們進行進一步的探究。因此，我們選擇了臨床上所見的3例典型的sAD患者，取得他們的尿液細胞誘導成IPS細胞，并初步探究這些iPS細胞向神經方向分化的能力。為今后sAD的機制研究，甚至臨床早期診斷以及藥物篩查打下基礎。

材 料 和 方 法

1 一般資料

選取了3例典型散發性阿爾茨海默病患者，分別來自中山大學附屬第六醫院和佛山市第一人民醫院，入組的AD患者均符合目前臨床上廣泛運用的美國國家衰老研究所和阿爾茨海默病學會診斷標準：(1)存在早期、顯著的情景記憶損害，簡短精神狀態檢查(min-mental state examination,MMSE)得分低于24分；(2)MRI分析顯示海馬、內嗅區、杏仁核等結構的萎縮;(3) 排除額顳葉癡呆、路易體癡呆以及血管性癡呆等非AD性癡呆。經患者或家屬同意并簽字，見表1。

表1 患者信息

2 細胞、質粒和主要試劑

2.1 細胞和質粒 人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)H1、正常人iPS細胞UC05及質粒PCEP4-E02ST2K、PCEP4-miR-302 cluster均由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院潘光錦研究組惠贈。

2.2 培養基及配方 尿細胞原代培養基為REGM Bullet Kit，購自Lonza；hESCs及iPSCs培養基為mTeSR1，購自Stem Cell；N2B27培養基為 (1% N-2 supplement+99% DMEM/F12)+(2% B-27 supplement+98% Neurobasal)；KSR培養基:10% 血清替代物(Knockout serum replacement, KSR)+39% DMEM/F12+0.5% L-GlutaMax+0.5% NEAA+0.1% β-巰基乙醇;N-2 supplement、B-27 supplement、Neurobasal基礎培養基購自Life Technologies；DMEM/F12基礎培養基、KSR、L-GlutaMax、NEAA、β-巰基乙醇購自Gibco。

2.3 其它主要試劑 DFBS、0.25% 胰酶-EDTA消化液、膠原酶IV購自Gibco；Matrigel購自BD；明膠(Gelatin)、Accutase細胞消化液、Smad通路抑制劑SB431542水合物和dorsomorpin、微管相關蛋白2(microtuble-associated protein 2, MAP2)、膠質細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、tubulin抗體購自Sigma；Oct-4抗體、階段特異性胚胎抗原4(stage-specific embryonic antigen 4,SSEA4)抗體、TRA-1-60抗體、TRA-1-81抗體購自Abcam；Pax6抗體、Sox1抗體、Sox2抗體購自Millipore；成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子購自Invitrogen；Dispase消化酶購自Life Technologies。

3 主要方法

3.1 尿液細胞的收集與培養 預先用1%的明膠鋪于6孔板中，1 mL每孔，置于培養箱中包被20 min以上。用無菌瓶收取200 mL左右尿液，400×g離心10 min，去上清，剩余約2～3 mL，加50 mL PBS洗1遍，400×g離心10 min，用2 mL REGM培養基重懸，接種于明膠包被好的6孔板中。將處理好的細胞置于37 ℃培養箱中，隔天半換液，約3～5 d可見細胞貼壁。當細胞長至每孔60%以上(7～14 d左右)時予以傳代。用0.25%的胰酶消化，接種于10 cm盤內。隔1～2 d換液1次，約 1 周時間可見細胞長滿10 cm盤。

3.2 利用非病毒方法進行iPS細胞的重編程 將準備好的10 cm盤細胞用0.25%胰酶消化，離心去上清；根據說明書準備好電轉溶液和質粒(PCEP4-E02ST2K、PCEP4-miR-302 cluster)，按儀器(NucleofectorTM2b Device，Lonza)說明進行瞬時轉染，導入帶有Oct4、Sox2、Klf4和SV40LT的質粒。電轉后第 1 天用REGM培養，根據細胞密度，1 個10 cm盤細胞接種于6孔板2～3個孔。第2 天換成mTeSR1培養基繼續培養。隔天換液，注意觀察細胞形態變化。

3.3 iPS細胞的培養及純化 約2周左右可見原代細胞出現較明顯形變，18 d左右可見iPS克隆形成。成熟的iPS克隆細胞之間聯系緊密，與原代細胞的分界較為清晰。此時可在顯微鏡下挑取iPS細胞克隆，重新接種于Matrigel包被的24孔板內，待克隆長大后再逐漸傳代到12孔板和6孔板中。擴增過程中注意觀察細胞形態，當混雜有其它非iPS細胞時要及時純化。純化方法主要有以下幾種：當分化細胞較少且位置局限時，可用細針于顯微鏡下刮除，或者直接用吸引器吸除；分化細胞較多且位置分散時，可用膠原酶Ⅳ消化30～60 min，iPS細胞由于貼壁較松，更容易被消化下來，以此達到純化目的。

3.4 定向誘導iPS細胞向神經方向分化 將無分化的iPS細胞接種于Matrigel包被的 6 孔板中，待細胞密度達到60%～70%時更換誘導培養基[N2B27培養基+SB431542(5 μ/L)+dorsomorpin(1 μmol/L)]。第8 天撤掉SB431542和dorsomorpin。約第16 天可見神經花環結構形成，挑取花環結構的細胞，懸浮培養并進行鑒定。

3.5 Real-time PCR鑒定各基因的表達 Trizol裂解細胞，提取總RNA。使用SYBR Premix EX Taq試劑盒進行real-time PCR，擴增多能性基因Oct-4、Sox2、Nanog及神經干細胞相關基因PAX6、Nestin、Sox1、Sox2、Vimentin。GAPDH作為內參照。引物序列見表1。

表1 引物序列表

4 統計學處理

使用Graphpad Prism 6.0軟件對實驗數據進行分析處理。數據用均數±標準差(mean±SD)表示。各基因在不同細胞中的表達差異采用單因素方差分析檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 AD患者尿液來源的細胞均能成功誘導成為iPS細胞

按上述步驟收取患者尿液細胞后，約3 d可見細胞貼壁(圖1)。至第8 天細胞長至每孔60%以上。傳代到10 cm盤內繼續擴增，約 12 d時可見細胞布滿10 cm盤。對擴增好的尿細胞進行電轉染，轉染后10 d AD患者來源的原代細胞可見不同程度的形變，鏡下見原代細胞逐漸由梭型轉變成圓形，聚集成團，細胞核比例增大。18 d左右可見成簇的iPS克隆形成，AP染色可初步判斷這些細胞存在干細胞特性(圖2)。這些克隆挑出后可進行擴增和穩定傳代。對所得到的iPS細胞(圖3A)進行real-time PCR鑒定(圖3B)，病人來源的iPS細胞均有內源性干性基因Oct4、Sox2、Nanog的表達。我們以人胚胎干細胞H1作為陽性對照，其中Oct4表達量較H1相近，Sox2表達量略低,而Nanog表達普遍比H1高。免疫熒光鑒定(圖3D)也發現Oct4、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81的蛋白表達，Oct4、SSEA4的表達與H1相近，而TRA1-60、TRA1-81的表達量略低，在同樣參數下激發的熒光強度較弱。核型鑒定均未出現異常(圖3C)。結果表明所有AD病人尿液來源的原代細胞均成功重編程為iPS細胞，這些細胞形成存在類似于人胚胎干細胞的特性，但也有一定區別。

2 AD患者來源的iPS細胞均能夠向神經方向分化，形成有功能的神經元

為了觀察AD患者來源的iPS是否能夠正常進行神經分化，我們參照文獻，在N2B27培養體系加入2個Smad通路的抑制劑SB431542和dorsomorpin，定向誘導iPSCs向神經方向分化[9-10]。第8 天時觀察細胞核質比變小，已基本失去干細胞形態，誘導第14～16 天可見神經花環形成，將花環挑出后懸浮培養，形成透亮的神經球(圖4A)。取神經球進行real-time PCR鑒定(圖4C)，結果顯示這些神經球已基本無胚胎干細胞特異的基因Oct4和Nanog表達，而表達神經干細胞相關基因如Pax6、vinemtin、nestin等，且同一個基因不同細胞間的表達量無明顯差異(P>0.05)。發現將神經球消化貼壁后進行免疫熒光鑒定，可見患者來源的神經干細胞均有表達Pax6、Sox1、Sox2等特異性蛋白(圖4B)。貼壁分化14d后進行免疫熒光鑒定，可見MAP2、tubulin、GFAP等神經細胞標志物的表達，說明這些神經具備分化成為神經元以及神經膠質細胞的能力(圖4D)。繼續分化至30 d，膜片實驗可檢測到與正常神經元類似的鈉鉀電流活動以及動作電位情況(圖4E、F)，表明分化形成的神經元具有正常電生理活性。

Figure 1.The primary cultured urine-derived cells from the AD patients.

Figure 2.Generation of iPSC lines. The transformation of primary cells during reprogramming.

討 論

阿爾茨海默病是長期以來困擾科學家們的一大難題。早期的AD研究主要局限于尸檢來源的大體模型、動物模型以及一些非人類神經元的細胞模型。然而大體模型只能展現疾病的終末狀態；鑒于種屬之間的巨大差異，動物模型難以重復人類AD的病程。我們在以往的工作中也使用過轉入swAPP基因(一種FAD相關的突變基因)的HEK293細胞以及秀麗線蟲作為AD的疾病模型[11-12]進行相關的藥物研究。然而僅僅導入1個突變基因的細胞并不能很好地代表這個疾病，尤其是sAD，線蟲模型亦是如此。因此，我們一直致力于尋找和建立更具代表性的疾病模型，以便更好地探究AD的發病機制和治療手段。誘導多能干細胞的出現為AD研究提供了新的思路，許多研究發現，由iPS細胞誘導分化的神經元細胞能夠特異性表達AD的相關病理表型[7-8, 13]。我們認為構建AD患者來源的iPS細胞并誘導其神經分化將為AD研究提供很大幫助。

本實驗中得到的典型sAD患者的iPS細胞，具備類似于胚胎干細胞的形態、類似的基因以及蛋白表達，且其誘導過程中細胞形態、各種干性基因的表達均未發現異常。雖然結果中iPSCs的干性基因表達與人胚胎干細胞存在差異，但這些差異并不顯著(在0.5～2倍之間)；且對照組正常人來源的iPS細胞UC05細胞的干性基因表達與人胚胎干細胞之間同樣存在細微差異，因此可以認為這些差異來源于iPS細胞本身，與AD疾病無直接關系。綜上，此次所獲取的患者來源的細胞均可正常進行重編程。

所有患者的原代細胞直接從尿液中分離[14]，不同于以往常用的取皮膚或者身體其它部分的組織進行原代細胞分離和培養，尿液來源不僅充足方便，而且把對患者的傷害降到了最小，更加利于臨床應用。同時也驗證了AD患者尿液中來源的細胞可以正常重編程為iPS細胞。在誘導方法上，經典的iPS重編程使用逆轉錄病毒方法，然而逆轉錄病毒可隨機整合到宿主染色體中，干擾宿主其它基因的功能，甚至激活癌基因，有致癌的危險。本次實驗中iPS細胞的重編程采用電轉化方法，避開了病毒的隨機插入問題，得到的iPS細胞相對更為安全，為今后進一步的臨床應用打下基礎。

為了觀察這幾例患者來源的iPS細胞是否能夠正常進行神經分化，我們參照文獻，利用成熟的單層貼壁誘導的方式，定向誘導iPS細胞向神經方向分化。結果表明所有患者的iPS細胞均能正常向神經方向分化。對于這幾例iPS初步分化結果顯示，在iPS細胞向神經細胞分化的階段其分化效率與正常人來源的無異，且定向分化形成的神經干細胞以及神經元與UC05及hESCs來源的細胞在各項神經細胞標志物的表達，以及電生理活性方面沒有明顯區別。許多其它實驗也得到過類似的結果[7, 15-16]。這表明AD雖然以神經元的過度凋亡為重要表型之一[17]，但在神經系統形成的早期階段對神經發育并無影響。另外，也可能由于樣本量的不足和檢測手段的局限，未能發現其中更為細微的差別。

Figure 3.The identification of iPSCs. A: the characteristics of iPSC clones； B: mRNA expression of Oct4, Sox2 and Nanog relative to H1 cells； C: karyotype identification； D: immunofluorescence identification. AMD01～03: AD patients 01～03; C1～C4: clones 1～4; P6～P9: passages 6～9; P40: passage 40. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs H1.

Figure 4.Neural conversion of human iPS cells. A: the transformation of iPSCs during neural differentiation； B: immunofluorescence shows most of these were Pax6, Sox1, Sox2 positive cells； C: the expression of neural related genes (Sox1, Sox2, Pax6, nestin, vinemtin) were detected by real-time PCR (Mean±SD.n=3); D: after 2 weeks of spontaneous differentiation, the tubulin (+) /MAP2 (+) neurons and GFAP (+) neural glial cells were observed； E: current-clamp recording showing voltage-gated ion channels from a neuron differentiated from patients-derived iPSCs； F: a representative train action potentials in a neuron.

sAD的發病機制眾說紛紜。近幾年利用iPS技術進行AD的研究中發現，sAD患者iPSCs分化來源的神經細胞表現出多種不同表型，包括細胞外Aβ40、p-tau的升高[7]，細胞內Aβ寡聚體的升高[8]，或是不表現病理特征，與正常對照一致。這便提示我們在如今的sAD的人群中，可能存在不同的分型。本實驗只是初步鑒定了所獲得的AD患者來源細胞的iPSCs重編程以及神經分化能力，對于AD相關的其它表型還有待進一步探究。接下來我們希望繼續尋找更多典型AD病例，擴大樣本量，建立sAD患者特異性的iPS細胞庫，從而為今后深入研究AD的致病機制甚至找到sAD不同亞型、開發新型安全治療藥物以及尋找更優化的治療方案提供便利。與此同時，干細胞治療是神經系統退行性疾病的一個新治療方向。iPS細胞由于其免疫排斥低及來源廣泛的巨大優勢，為干細胞治療廣泛應用于臨床帶來了希望[18]。這些AD患者經iPSCs來源的神經細胞經初步檢測，可以確定其具有正常神經元的生理功能。經過進一步檢測后，那些不帶有AD相關表型的神經細胞則可能成為今后干細胞治療的一大細胞來源。

致謝: 本工作得到中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院提供的重編程所需質粒PCEP4-E02ST2K、PCEP4-miR-302 cluster；廣州生物醫藥與健康研究院的潘光錦老師、蔡秀娟老師，以及蘇整會、李迪、馬寧、單永禮等同學在細胞培養技術和分子生物實驗技術方面給予了寶貴的指導和幫助，在此一并致以由衷的感謝！

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Generation of induced pluripotent stem cells and neural cells from urine-derived cells of Alzheimer disease patients

WEI Rui1, LI Zhong1, CAI Xiu-juan2, HE Lu1, LEI Qing-feng1

(1DepartmentofNeurology,TheSixthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;2GuangzhouInstitutesofBiomedicineandHealth,ChineseAcademyofSciences,Guangzhou510530,China.E-mail:zslyjohn@163.com)

AIM: In this study, we aim to obtain the induced pluripotent stem cells (iPSCs) from the patients with sporadic Alzheimer disease (AD). METHODS: Three typical Alzheimer’s patients were chosen, and the epithelial cells were isolated from their urine. We reprogrammed these cells into induced pluripotent stem cells by transfection of 4 factors (Oct4， Sox2, Klf4 and SV40LT) with the technique of electro-transfection. After getting these iPSCs, we continue to differentiate them into neural cells by a specific method—dual inhibition of Smad signaling. RESULTS: The primary cells from 3 AD patients were successfully reprogrammed to iPSCs, and these patients-derived iPSCs were differentiated into neural cells. There was no significant difference, during iPSCs reprogramming and neural differentiation, between cells from AD patients and normal people. CONCLUSION: The urine cells from AD patients were able to transfer to iPSCs, functional neurons and neurogliocytes.

Alzheimer disease; Induced pluripotent stem cells; Neural differentiation

1000- 4718(2015)03- 0421- 07

2014- 09- 05

2014- 10- 28

廣東省醫學科學研究基金資助項目(No. A2012211);天河區2014年度科技計劃項目(No.201404kw028)

△通訊作者 Tel: 020-38274637； E-mail: zslyjohn@163.com

R749.1+6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.007