FAT/CD36在高脂喂養小鼠脂肪組織炎癥中的作用*

張艷艷， 趙 蕾， 謝云霞， 陳壓西， 阮雄中

(重慶醫科大學脂糖代謝性疾病重慶市重點實驗室，脂質研究中心，重慶 400016)

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FAT/CD36在高脂喂養小鼠脂肪組織炎癥中的作用*

張艷艷， 趙 蕾△， 謝云霞， 陳壓西， 阮雄中

(重慶醫科大學脂糖代謝性疾病重慶市重點實驗室，脂質研究中心，重慶 400016)

目的： 探討脂肪酸轉運酶/白細胞分化抗原36 (fatty acid translocase/CD36，FAT/CD36)在高脂飲食誘導的小鼠脂肪組織炎癥中的作用。方法: 將6周齡雄性C57BL/6J小鼠分別隨機分為普通飲食組和高脂飲食組，喂養14周后，ELISA測定血清游離脂肪酸(FFA)含量，應用熒光實時定量 PCR和Western blotting檢測脂肪組織中FAT/CD36及炎癥/趨化因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-1)mRNA和蛋白的表達，免疫組織化學染色檢測脂肪組織巨噬細胞浸潤，比較高脂喂養14周的野生型小鼠和CD36基因敲除小鼠的脂肪組織炎癥反應情況。結果: 與普通飲食組相比，高脂飲食能增強C57BL/6J小鼠脂肪組織的FAT/CD36及炎癥/趨化因子的表達，促進巨噬細胞在脂肪組織的浸潤。與高脂飲食喂養的野生型小鼠相比，CD36 基因敲除小鼠的脂肪組織炎癥因子、趨化因子表達明顯降低，脂肪組織巨噬細胞浸潤減少。結論: 高脂飲食通過上調脂肪組織FAT/CD36的表達激活了脂肪組織炎癥。

脂肪酸轉運酶/白細胞分化抗原36； 高脂飲食； 脂肪組織； 炎癥

隨著人民生活水平的提高及運動量的減少，肥胖、糖尿病、脂肪肝、高血壓、血脂異常等代謝性疾病已成為嚴重影響我國人民健康的多發病及常見病。近期的研究表明炎癥反應是肥胖及其相關代謝性疾病發生發展的核心環節[1]。2006年Hotamisligil[2]首次提出“代謝性炎癥”的概念，主要指由營養物和代謝產物所觸發、多種細胞和細胞因子共同參與的全身性、系統性的低峰度炎癥。

脂肪酸轉運酶/白細胞分化抗原36(fatty acid translocase/CD36, FAT/CD36)是一個88 kD的膜糖蛋白，屬于B 類清道夫受體家族，廣泛表達于多種細胞(肌細胞、單核細胞、巨噬細胞和肝細胞等)，尤其在脂肪細胞中高表達[3]。FAT/CD36不僅能直接介導脂肪酸的攝取和轉運，還能識別眾多致炎性的內源性代謝產物，如氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)、非修飾的脂蛋白和淀粉樣蛋白等，被認為是將機體的代謝和炎癥這兩大過程有機聯合在一起的重要“橋梁”[4]。既往研究表明脂肪組織是代謝性炎癥產生的主要場所[3-5]。然而，FAT/CD36在脂肪組織代謝性炎癥中的作用目前國內尚未見相關報道。因此本研究擬應用C57BL/6J小鼠、野生型(widetype，WT)/CD36基因敲除(CD36 knockout，CD36 KO)小鼠作為動物模型，觀察高脂飲食對脂肪組織FAT/CD36表達和炎癥反應的影響，并初步探討CD36基因缺失對高脂喂養小鼠的脂肪組織炎癥的作用。

材 料 和 方 法

1 動物

WT、CD36 KO小鼠由美國Maria Febbraio教授惠贈，C57BL/6J小鼠購自重慶醫科大學動物中心。

2 主要試劑

普通飼料(normal chow diet，NCD)和高脂飼料購自Research Diets；Trizol RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix均購自TaKaRa；細胞總蛋白提取試劑盒購自凱基公司；免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司；游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)測定試劑盒購自浙江東甌公司；CD36、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)Ⅰ抗購自Santa Cruz；白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)抗體購自Millipore；單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、巨噬細胞炎性蛋白-1 (macrophage inflammatory protein-1，MIP-1)抗體購自上海生工生物工程公司；β-肌動蛋白 (β-actin)Ⅰ抗和Ⅱ抗購自北京中杉金橋公司；F4/80 Ⅰ抗購自Biolegend；硝酸纖維膜和化學發光試劑購自GE。

3 主要方法

3.1 動物選擇與分組 將6 周齡的雄性C57BL/6J小鼠隨機分為普通飲食(NCD)組和高脂飲食(high-fat diet，HFD)組，喂養14周。并分別選取8只6 周齡的雄性WT和CD36 KO小鼠，給予高脂喂養14周。

3.2 Real-time PCR檢測相關基因mRNA的表達 Trizol提取細胞總RNA。將1 μg總RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件為：42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，保存于-20 ℃。再取2 μL逆轉錄產物進行real-time PCR，以β-actin為內參照，反應體系為25 μL。擴增條件： 95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環。引物序列見表1。

3.3 Western blotting檢測相關蛋白的表達 試劑盒提取細胞蛋白，SDS-PAGE分離蛋白樣品，轉膜。室溫封閉1 h后，將膜用 I 抗(CD36、TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MIP-1和β-actin)室溫下孵育2 h，然后用辣根過氧化物酶標記的 II 抗室溫下孵育1 h。最后用化學發光試劑盒檢測信號，并用Quantity One軟件對條帶的強度(亮度×面積)進行定量。

3.4 免疫組織學染色 按照試劑盒說明書，采用2步法檢測脂肪組織內F4/80蛋白表達，DAB顯色。I抗濃度1∶ 200。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

3.5 酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 按照試劑盒說明書，檢測血清中FFA含量。

4 統計學處理

用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據均以均數±標準誤(mean±SEM)表示。采用t-test對兩樣本進行比較檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 高脂飲食能促進C57BL/6J小鼠的高脂肪酸血癥和脂肪組織CD36表達

不同飲食喂養C57BL/6J小鼠14周，收集動物血清和脂肪組織樣本，用ELISA檢測小鼠血清FFA，用real-time PCR檢測CD36 mRNA表達，Western blotting及免疫組織化學檢測C57BL/6J小鼠脂肪組織CD36蛋白的表達。如圖1所示，與普通飲食組相比，高脂飲食可以使小鼠血清的FFA明顯增加，使脂肪組織內的CD36 mRNA約升高了3.23±0.64倍，CD36蛋白表達約升高了0.49±0.10倍差異有統計學意義(P<0.05)。

2 高脂飲食能促進C57BL/6J小鼠脂肪組織的炎癥反應

與普通飲食組相比，高脂飲食可使C57BL/6J小鼠脂肪組織內炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的 mRNA分別約升高0.78±0.46、1.69±0.65、0.94±0.52倍(P<0.05)；趨化因子MCP-1和 MIP-1 mRNA分別約升高0.89±0.20、1.94±0.38倍(P<0.05)；C57BL/6J小鼠脂肪組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、趨化因子MCP-1、MIP-1的蛋白表達也呈明顯升高趨勢(P<0.05)，同時巨噬細胞浸潤顯著增加(巨噬細胞標記物F4/80染成黃色，箭頭指示處)，見圖2。

Figure 1.HFD upregulated CD36 expression in the adipose tissues of C57BL/6J mice. Mean±SEM. n=8. #P<0.05 vs NCD.

3CD36基因敲除可以減弱高脂誘導的脂肪組織炎癥反應

高脂喂養CD36 KO小鼠和WT小鼠14周后收集脂肪組織并做相應檢測。我們發現CD36 KO小鼠的脂肪組織炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的 mRNA含量分別為WT小鼠的56.0%±12.0%、35.0%±9.7%和27.0%±5.1%(P<0.05)；趨化因子MCP-1和 MIP-1的 mRNA表達為對照小鼠的59%±15%和43%±12%(P<0.05)；同時CD36 KO小鼠脂肪組織炎癥/趨化因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MIP-1的蛋白表達也明顯降低(P<0.05)，巨噬細胞浸潤顯著減少(巨噬細胞標記物F4/80染成黃色細胞較少)，見圖3。

Figure 3.The expression of cytokine and chemokine in the adipose tissues of WT and CD36 KO mice. Mean±SEM. n=8. #P<0.05 vs WT mice.

討 論

目前學界關于肥胖、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、脂代謝紊亂、高血壓等代謝性疾病的發病機制的研究報道很多，代謝性炎癥在其發生中的核心作用也越來越得到公認[6]，但是代謝性炎癥發生的具體分子機制目前尚未闡明。

既往研究提示，脂肪酸轉運蛋白FAT/CD36可能是細胞炎癥反應的一個關鍵蛋白[7]。在對動脈粥樣硬化和阿爾茨海默氏病的研究中發現，當CD36蛋白與其配體ox-LDL結合后，能募集TLR4/6受體形成CD36/TLRs多聚體，并誘導TLR4/6磷酸化，進而激活NF-kappaB通路，釋放氧化應激產物，促進巨噬細胞遷移，觸發炎癥反應[8]。

在本研究中，我們發現高脂喂養的C57BL/6J小鼠血清中的FFA含量增高，且脂肪組織CD36的mRNA和蛋白表達較普通飲食組均明顯增加，同時伴有脂肪組織炎癥因子/趨化因子表達水平及炎癥細胞浸潤的顯著增加。推測高脂條件下，小鼠血清中CD36的配體(如游離脂肪酸)含量增加，進而上調脂肪組織的CD36表達；CD36通路活化后可以激活NF-κB通路，產生并分泌大量的炎癥因子和趨化因子，從循環中募集巨噬細胞，促使大量巨噬細胞浸潤到脂肪組織中，活化的巨噬細胞又可以進一步產生和釋放炎癥/趨化因子，放大炎癥反應，最終導致脂肪組織代謝性炎癥的發生。病理狀態下，脂肪組織所產生和分泌的多種炎癥/趨化因子，可以通過自分泌、旁分泌和內分泌網狀信號旁路作用于脂肪組織局部和胰島、肌肉、肝臟等全身多種細胞，從而導致了胰島素抵抗等代謝性疾病的發生[9]。

為進一步確證脂肪酸轉運蛋白FAT/CD36是否在這一高脂飲食誘導的脂肪組織炎癥反應中扮演了重要角色，我們比較了WT和CD36 KO小鼠在高脂喂養條件下的炎癥情況。結果表明：CD36 KO小鼠脂肪組織中的炎癥反應較WT小鼠顯著降低，從而提示高脂誘導的小鼠脂肪組織代謝性炎癥的產生依賴于脂肪酸轉運蛋白FAT/CD36通路。

[1] Egger G, Dixon J. Should obesity be the main game? Or do we need an environmental makeover to combat the inflammatory and chronic disease epidemics? [J]. Obes Rev, 2009, 10(2):237-249.

[2] Hotamisligil GS. Inflammation and metabolic disorders[J]. Nature, 2006, 444(7121):860-867.

[3] Wellen KE, Hotamisligil GS. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue[J]. Clin Invest, 2003, 112(12):1785-1788.

[4] Silverstein RL, Febbraio M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behaviour[J]. Sci Signal, 2009, 2(72): re3.

[5] Wajchenberg BL, Nery M, Cunha MR, et al. Adipose tissue at the crossroads in the development of the metabolic syndrome, inflammation and atherosclerosis[J]. Arq Bras Endocrinol Metabol, 2009, 53(2):145-150.

[6] Hotamisligil GS, Erbay E. Nutrient sensing and inflammation in metabolic disease[J]. Nat Rev Immunol, 2008, 8(12):923-934.

[7] Stewart CR, Stuart LM, Wilkinson K, et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4 and 6 heterodimer[J]. Nat Immunol, 2010, 11(2):155-161.

[8] Harb D, Bujold K, Febbraio M, et al. The role of the scavenger receptor CD36 in regulating mononuclear phagocyte trafficking to atherosclerotic lesions and vascular inflammation[J]. Cardiovasc Res, 2009, 83(1):42-51.

[9] Tilg H, Moschen AR. Inflammatory mechanisms in the regulation of insulin resistance[J]. Mol Med, 2008, 14(3-4):222-231.

Role of FAT/CD36 in high-fat diet-induced adipose tissue inflammation

ZHANG Yan-yan, ZHAO Lei, XIE Yun-xia, CHEN Ya-xi, RUAN Xiong-zhong

(CentreforLipidResearch,ChongqingKeyLaboratoryofLipidandGlucoseMetabolism,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:laleinlz@hotmail.com)

AIM: To investigate the role of fatty acid translocase/CD36 (FAT/CD36) in adipose tissue inflammation induced by a high-fat diet. METHODS: C57BL/6J mice were fed with a normal-chow diet (NCD) or a high-fat diet (HFD) for 14 weeks. The content of free fatty acid (FFA) in the serum was measured by ELISA. The expression of CD36, cytokines and chemokines at mRNA and protein levels in the adipose tissues was determined by real-time polymerase chain reaction and Western blotting. Immunohistochemical staining was used to examine the macrophages infiltration in the adipose tissues. The inflammatory responses inCD36 knockout mice and wild type mice with high-fat diet were analyzed. RESULTS: The levels of FAT/CD36 were higher in HFD group than that in NCD group. HFD feeding enhanced the mRNA and protein expression of IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1 and MIP-1, as well as promoted macrophage infiltration in the adipose tissues. Interestingly, as fed with HFD, the expression of cytokines/chemokines and macrophage infiltration were significantly reduced in adipose tissues of theCD36 knockout mice, compared with the wild type mice. CONCLUSION: High-fat diet promotes adipose tissue inflammation in the mice in a FAT/CD36-dependent manner.

Fatty acid translocase/CD36; High-fat diet; Adipose tissues; inflammation

1000- 4718(2015)03- 0463- 05

2014- 09- 29

2014- 12- 09

國家自然科學基金資助項目(No. 81270493； No. 81200567)

△通訊作者 Tel： 023-68486780; E-mail: laleinlz@hotmail.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.014