系統性紅斑狼瘡中A20表達特點的研究*

張 帆， 朱麗花， 王 旭， 陳少華， 楊力建， 吳秀麗， 李 萡， 周 毅， 李揚秋,△

( 1廣東藥學院生命科學與生物制藥學院廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006； 暨南大學 2醫學院血液病研究所， 3第一附屬醫院風濕免疫科， 4再生醫學教育部重點實驗室，廣東 廣州 510632)

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系統性紅斑狼瘡中A20表達特點的研究*

張 帆1,2， 朱麗花3， 王 旭4， 陳少華2， 楊力建2， 吳秀麗2， 李 萡2， 周 毅3， 李揚秋2,4△

(1廣東藥學院生命科學與生物制藥學院廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006； 暨南大學2醫學院血液病研究所，3第一附屬醫院風濕免疫科，4再生醫學教育部重點實驗室，廣東 廣州 510632)

目的： 了解系統性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血中腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(TNFAIP3，也稱A20)、核因子κB(NF-κB)、黏膜相關淋巴瘤易位基因1(MALT1)及其轉錄本1(MALT1V1)的mRNA表達特點。方法: 采用real-time PCR法檢測21例SLE患者(其中合并硬皮癥2例，合并類風濕關節炎1例，合并淋巴瘤1例)及31例健康人外周血單個核細胞(PBMC)中MALT1、A20、NF-κB和MALT1V1 mRNA的表達情況。結果: SLE樣本中，A20 mRNA表達水平較健康人明顯降低(P<0.01)，MALT1和NF-κB也較健康人降低(P<0.01)。在健康人組，A20和NF-κB mRNA的表達水平未呈現明顯相關性，MALT1和NF-κB則呈正相關(P<0.05)；而在SLE組中，A20和NF-κB mRNA則顯示出顯著正相關(P<0.05)，MALT1和NF-κB則不存在相關性。SLE中MALT1V1表達量顯著低于正常人(P<0.05)，相關性研究還顯示，健康人中A20和MALT1V1存在正相關關系(P<0.01)，在SLE中則不存在(P>0.05)。結論: 本研究首先提供了MALT1-A20-NF-κB通路在SLE中的表達特點。SLE患者異常低表達A20，這可能與患者低免疫耐受相關，其與NF-κB表達的正相關性情況可能與其它因素的調控有關，有待進一步證實。

系統性紅斑狼瘡; A20; MALT1; NF-κB

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是自身免疫介導、以免疫性炎癥為突出表現的彌漫性結締組織病。SLE患者發病機制尚不十分明確，主要表現為自身免疫調節紊亂，預后差。研究表明, 免疫系統失衡在SLE發病中發揮了重要作用，從而導致免疫細胞活化和促炎因子的增多。免疫系統活化導致靶器官自身免疫復合物的沉積和組織破壞性T細胞的滲入，而促炎因子則有助于免疫活化狀態的維持。

A20，也稱為腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(tumor necrosis factor α-induced protein 3，TNFAIP3)，A20基因定位于染色體6q23.3，其cDNA序列為4 440 bp，其開放讀碼框為2 370 bp，編碼790氨基酸的90 kD蛋白。A20蛋白在羧基末端含有7 個Cys2-Cys2 鋅指(zinc finger，ZnF)基序，是一種新類型的鋅指蛋白，這些鋅指基序是NF-κB 信號轉導作用所必須的。而A20 的氨基端則含有一個基序，稱為卵巢腫瘤基序(ovarian tumor domain，OTU)，具有去泛素化蛋白酶活性作用。因此A20具有腫瘤抑制因子及炎癥信號轉導的中心調節因子NF-κB抑制因子的雙重功能[1-4]。它在天然免疫和過繼性免疫調節中發揮了重要作用，對免疫動態平衡有重要的調節作用[5]。A20缺失與炎癥介導的自身免疫性疾病和淋巴細胞腫瘤的發生發展關系密切[5-6]。近年研究發現，A20作為炎癥調控因子對SLE的發生發展起著重要的作用，A20基因的缺失、突變和甲基化與SLE的發生關系密切[7-10]。而黏膜相關淋巴瘤易位基因1 (mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1，MALT1)是NF-κB信號通路中的一種調控蛋白，在T細胞受體(T-cell receptor，TCR)介導的NF-κB的活化和調控淋巴細胞增殖和分化的過程中具有重要作用[11- 12]。基因庫資料顯示MALT1存在2種轉錄本，轉錄本2(MALT1V2)比轉錄本1(MALT1V1)缺少 33 個堿基，但未有2種轉錄本在正常人、血液腫瘤和免疫系統疾病中分布特點的報道。同時，MALT1作為一種蛋白酶可水解NF-κB負性調控因子A20。因此，A20和MALT1有可能在SLE 的發病中具有一定作用。MALT1在淋巴瘤和白血病中的作用及其與A20關系已有一定研究，但其在SLE患者中是否扮演一樣的角色還未見報道。同樣，盡管已發現A20基因的一些單核苷酸多態性可能是SLE的易感位點，但A20在SLE患者中的表達情況研究尚不充分，其調控機制也不明確。本研究通過觀察SLE 患者和正常人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中MALT1、A20和NF-κB mRNA的表達特點及其與SLE 疾病狀態的關系，期望進一步了解SLE細胞異常的分子機制。

材 料 和 方 法

1 樣本收集

收集暨南大學附屬華僑醫院2008年至2011年確診的SLE患者外周血標本21例(其中合并硬皮癥2例，合并類風濕關節炎1例，合并彌漫大B細胞淋巴瘤1例，無合并癥17例)，另收集31例健康人外周血標本作為對照組。

2 方法

2.1 RNA提取及cDNA合成 RNA提取采用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取RNA。另外，采用反轉錄酶試劑盒( BD)反轉錄合成cDNA 第1鏈;用RT-PCR 檢測β2-微球蛋白(β2-microglobulin, β2M)mRNA的表達情況以檢驗所合成cDNA 的質量。

2.2 引物設計 根據MALT1基因(Accession No: NM_006785, NM_173844),A20基因 (Accession No: NM_006290) 和NF-κB基因設計，引物均由上海英濰捷基有限公司合成。以β2M作為內參照設計上、下游引物，各引物序列見表1[13]。

表1 Real-time PCR使用的引物

2.3 實時定量PCR 利用SYBR GreenⅠ染料進行各基因的實時熒光定量PCR檢測，擴增總反應體系為20 μL，應用Real Master Mix試劑盒(Tiangen)，其中包括2×Real Mastr Mix 10 μL、10 mmol/L上、下游引物0.5 μL 以及1 μL cDNA。每1個標本均設復孔，每1個基因均設1個陰性對照孔。反應條件為95 ℃預變性15 min后，共進行45個循環擴增，每一循環包括95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s。隨后,以0.17 ℃/s變化速度從55 ℃到95 ℃，每隔2 s記錄1次熒光值,獲得熔解曲線。反應在CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)中進行[14]。

2.4 mRNA表達水平的計算方法 采用相對定量法分別分析SLE患者和健康人外周血細胞中MALT1、A20、NF-κB mRNA表達水平的差異，以β2M為內參照，利用Ct值，計算SLE患者和健康人各基因的相對表達量。相對定量法的計算公式為2-ΔΔCt[15]。

3 統計學處理

利用SPSS 17.0軟件進行相關分析 SLE組和健康人組A20/MALT1/NF-κB mRNA，檢測數據以中位數表示，各組mRNA表達水平比較采用秩和檢驗(Wilcoxon)，并采用Pearson’s correlation進行相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MALT1、A20和NF-κB mRNA在SLE中的表達水平

Real-time PCR結果顯示，SLE組和健康對照組樣本均表達MALT1、A20和NF-κB mRNA，在健康對照組中，各樣本之間MALT1、A20和NF-κB的表達水平比較接近，在SLE患者中3種mRNA的表達水平差異較大，應用獨立樣本秩和檢驗進行分析發現，在SLE患者中，A20的表達水平顯著低于健康對照組(P<0.01)，MALT1表達水平低于健康對照組(P<0.01)，NF-κB的表達水平較健康對照組也明顯減低(P<0.05)。根據其表達水平特點，分為高表達和低表達2組(P<0.01)；此外，根據SLE合并其它疾病與否分為2組，合并其它疾病組4例，均為A20低表達(P<0.01)，見表2。

表2 健康對照和SLE組中A20、MALT1和NF-κB mRNA的相對表達水平

HI: healthy individuals.**P<0.01vsHI.

另外，我們還分別分析A20高或低表達組及有無合并癥組樣本mRNA的表達水平差異，結果顯示這些組間并無顯著差異(P>0.05)。

2 SLE中MALT1兩種轉錄本的表達特點

根據NCBI基因庫報道，MALT1有2種轉錄本，兩者的表達水平在不同細胞和疾病中存在差異[16-17]。本研究分別檢測同時含有2種MALT1轉錄本和僅含MALT1轉錄本1的PCR產物[16]，通過MALT1V1/MALT1可間接得出HALT1V2表達量。進一步比較正常人、SLE樣本中MALT1兩種轉錄本的表達情況，結果可見，所有樣本均表達2種轉錄本，在正常人和SLE的大多數樣本中MALT1V2比MALT1V1表達量要高。SLE組的MALT1V1表達量與正常人比較顯著降低(P<0.05)。MALT1V1/MALT1百分比表達稍高于正常人，但無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 健康人和SLE中MALT1兩個轉錄本相對表達情況

HI: healthy individuals.*P<0.05vsHI.

3 SLE中A20、NF-κB和MALT1兩個轉錄本表達水平相關性

理論上，MALT1-A20-NF-κB信號分子的表達水平之間應存在一定的相關性，在健康對照組中，可以發現MALT1和NF-κB的表達水平呈現正相關(P<0.05)，見圖1。MALT1V1、MALT1V1/MALT1百分比和A20呈現明顯負相關(P<0.05)，見圖2、3。而MALT1和A20，A20和NF-κB表達水平之間無顯著的相關性(P>0.05)。在SLE患者組中，A20和NF-κB則存在明顯正相關(P<0.01)，見圖1。而MALT1和A20、MALT1和NF-κB則不存在明顯相關性(P>0.05)。

Figure 1.Correlations between NF-κB expression and A20 or MALT1V1 in healthy group and SLE group.

Figure 2.Correlations between expression of A20 and MALT1V1 in healthy group and SLE group.

Figure 3.Correlations between expression of A20 and MALT1V1 in healthy group and SLE group.

討 論

SLE是一種涉及多個免疫調節基因功能異常的慢性炎癥性疾病。而A20基因在負性免疫調節中起著關鍵作用。我們的研究結果顯示在SLE中A20基因表達明顯降低，而NF-κB、MALT1基因表達也存在下調趨勢。SLE患者中A20與NF-κB基因的表達顯示明顯正相關，而MALT1與NF-κB、A20和MALT1V1、MALT1V1/MALT1百分比的正相關關系則被打破。國內外研究表明，A20是NF-κB的負調控因子，但本研究結果卻顯示在SLE中，兩者呈正相關關系，這可能與NF-κB同時接受其它因素的調控有關。在正常人中因MALT1(本研究結果提示主要為MALT1V1調控作用)對A20具有水解酶作用，MALT1間接調控NF-κB改變，從而影響T細胞的活化和增殖，形成了精密的MALT1-A20-NF-κB信號調節途徑。然而在SLE中，MALT1并未見到對A20有抑制作用，從而失去了對NF-κB的調控能力。我們推測，其它異常因素的調控使得A20雖在mRNA水平表達下降，卻仍然出現了NF-κB表達下降，T細胞免疫功能也受到抑制。而MALT1和MALT1V1降低這一現象可能是由于A20表達下降后使對A20具有降解作用的MALT1反饋性降低引起，而它是否與SLE病程和治療情況有關尚待進一步研究。我們在多發性骨髓瘤病人中，也發現類似的改變特點[18]，提示NF-κB表達可能涉及多重調控。本文首次報道了SLE中A20的調控因素MALT1的表達特點，分析了其2個轉錄本的分布情況。健康人A20和MALT1V1存在的負相關關系在SLE患者中被打破，這可能由于A20功能異常或MALT1V1之外的其它調控因素作用的結果，但由于尚未有其它研究報道SLE中MALT1的改變特點，2個轉錄本的功能也不明確，尚需做進一步研究。

根據目前研究，A20表達異常導致SLE的病理機制可歸納為以下幾方面：(1)A20的低表達造成自身反應性T細胞過度活化，這是SLE的關鍵致病因素。A20通過去泛素化MALT1擾亂TCR信號向NF-κB的傳遞，從而抑制T細胞的活化[19]，進而引起組織器官損害；(2)A20的降低增強了自身免疫復合物的沉積，這也是SLE的重要特點。A20阻礙了B細胞和樹突狀細胞的生成和活化[20-21]。A20在B細胞中的缺失增加了B細胞的增殖和自身抗體的生成[22]。因此，A20 的低表達導致B細胞的過度活化和自身抗體的聚積；(3)A20的低表達促使IL-4 、IL-6、TNF-α和IFN-γ等促炎癥因子的血清水平升高，這是SLE的另一個特性[23-24]。A20缺失小鼠血清中含高水平的炎癥細胞因子，并表現為持續性的NF-κB活化和巨噬細胞產生高水平的TNF-α[25]。A20在RA和其它自身免疫性疾病中的低表達同樣證明這一機制[26-27]。總之，由于通常情況下A20對多種免疫細胞的活化具有調控作用，而當A20表達降低時可引起異常的免疫應答，是SLE發生中的一個重要因素。而造成A20低表達原因可能與調控A20的上游分子如MALT1，以及A20基因的突變、缺失或啟動子甲基化等相關[10, 28]，至于在本研究中SLE病人樣本A20基因是否同樣存在基因突變等，還有待后續的研究。

總之，在本研究中，我們首次報道了SLE中MALT1- A20-NF-κB表達模式的特點和MALT1兩個轉錄本的分布情況。總的來說，SLE患者出現了A20的低表達和功能異常，而SLE的發生提示NF-κB可能受除A20以外的其它因素調節或A20存在轉錄后水平的調控，其可能與疾病的緩解和治療有關。此外，我們的研究僅限于real-time PCR方法檢測mRNA水平表達，蛋白定量和機理的闡明還有待下一步的研究，并期望能明確T細胞中A20、MALT1V1和MALT1V2的功能及其與SLE疾病轉歸的相關性。

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Expression of A20 in patients with systemic lupus erythematosus

ZHANG Fan1, 2, ZHU Li-hua3, WANG Xu4, CHEN Shao-hua2, YANG Li-jian2, WU Xiu-li2, LI Bo2, ZHOU Yi3, LI Yang-qiu2, 4

(1GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBiotechnologyCandidateDrugResearch,CollegeofLifeScienceandBio-pharmacopedics,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,3DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospital,4ChinaKeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEducation,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:jnyangqiuli@163.com)

AIM: To investigate the expression and regulation of A20 in healthy individuals and the patients with systemic lupus erythematosus (SLE). METHODS: The expression levels of A20, NF-κB, MALT1, and MALT1V1 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of the patients with SLE (including 2 cases with scleroderma, 1 case with rheumatoid arthritis, and 1 case with lymphoma) were analyzed by real-time PCR. RESULTS: A significantly lower A20 expression level was found in the PBMC from SLE group compared with the healthy controls, while the expression levels of MALT1 and NF-κB were also decreased. In addition, no significant correlation between A20 and NF-κB expression levels in healthy group was observed, but a positive correlation was found in SLE group (P<0.05). A significant positive correlation between MALT1 and NF-κB expression levels in healthy group (P<0.05) was observed, and no significant correlation was found in SLE group. The expression level of MALT1V1 in SLE group was significantly lower than that in healthy control group, and there was a positive correlation between A20 and MALT1V1 in healthy volunteers (P<0.01), but that did not exist in SLE group. CONCLUSION: The characteristics of the expression pattern of MALT1-A20-NF-κB in the SLE patients were presented. Lower level of A20 expression was found in the SLE patients, in particular with other autoimmune disease or lymphomas, indicating the lower immune tolerance in SLE. The positive correlation of A20 and NF-κB may relate to positive regulation of MALT1.

Systemic lupus erythematosus; A20; MALT1; NF-κB

1000- 4718(2015)03- 0518- 06

2014- 08- 06

2015- 01- 20

國家自然科學基金資助項目(No. 91129720)

△通訊作者 Tel: 020-85226877; E-mail: jnyangqiuli@163.com

R363.2； R593.24+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.023