依達拉奉對驚厥持續狀態幼年大鼠海馬中caspase-3和caspase-12表達的影響

黃紅宇， 李光乾

(杭州市兒童醫院神經科，浙江 杭州 310014)

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依達拉奉對驚厥持續狀態幼年大鼠海馬中caspase-3和caspase-12表達的影響

黃紅宇， 李光乾△

(杭州市兒童醫院神經科，浙江 杭州 310014)

目的： 探討依達拉奉(edaravone，ED)對幼年大鼠驚厥持續狀態(status convulsion，SC)后海馬中caspase-3和caspase-12表達的影響。方法: 將195只SD幼年雄性大鼠隨機分為生理鹽水對照組(NS組)、SC組和ED組；各組又均按時點分為4 h、12 h、24 h、48 h和72 h 5個亞組，每組13只。采用氯化鋰-匹魯卡品化學點燃法制備幼年大鼠SC模型。應用免疫組織化學法檢測大鼠海馬中caspase-3和caspase-12蛋白表達情況，逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)法檢測caspase-3和caspase-12 mRNA的表達。結果: (1)免疫組織化學法檢測SC 24～72 h組幼年大鼠海馬中caspase-3表達增強，與NS組比較差異有統計學意義(P<0.05)；與SC組比較，ED 48～72 h組的caspase-3 表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；RT-PCR法檢測結果顯示caspase-3 mRNA的表達趨勢與蛋白基本相似。(2)免疫組織化學法檢測SC組幼年大鼠海馬中12～72 h組caspase-12表達增強，與NS組比較差異有統計學意義(P<0.01)；與SC組比較，ED 24～72組caspase-12表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；RT-PCR法檢測結果顯示caspase-12 mRNA的表達趨勢與蛋白基本相似。(3)經比較，ED組Ⅴ級驚厥率較SC組低，差異有統計學意義(P<0.05)；且ED組驚厥潛伏期也較SC組明顯延長，差異有統計學意義(P<0.05)。結論: 依達拉奉可抑制匹魯卡品所致SC大鼠海馬caspase-12和caspase-3的表達，提示依達拉奉對SC引起的腦損傷可能有保護作用。

Caspase-3； Caspase-12； 驚厥持續狀態； 依達拉奉

驚厥(convulsion)是常見的小兒神經系統急癥，系中樞神經系統或各種全身性疾病使腦細胞功能紊亂，部分神經元突然異常和過度超同步化放電所致。發病率為3%～5%，其中20%為反復驚厥或驚厥持續狀態(status convulsion，SC)。反復的驚厥或SC易引起神經元不可逆損傷，導致海馬等部位的神經元壞死和凋亡[1]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)啟動的凋亡途徑是近年才發現的一種新的凋亡途徑，已有研究證明反復驚厥或SC也可誘導ERS，且與神經元凋亡有密切關系[1]。Caspase-12是ERS介導凋亡的關鍵效應酶[2]，但其與線粒體損傷途徑密切相關的caspase-3是否確實存在交連，尚未有定論。依達拉奉(edaravone，ED)是一種新型的自由基清除劑和抗氧化劑，在缺血缺氧性腦病的研究中證實其具有神經保護等作用[3]；我們的前期研究表明ED對驚厥性腦損傷也有保護作用[1, 4]，但其保護機制有待于深入研究。本實驗通過制作大鼠SC模型，觀察SC大鼠海馬半胱氨酸門冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)-3和caspase-12蛋白及其mRNA的動態變化，并應用ED進行干預。旨在探討ED對SC后幼年大鼠海馬caspase-3與caspase-12表達的影響，以了解ED對SC大鼠海馬細胞凋亡通路的調控作用。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和主要試劑

清潔級19 d齡健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠195只，體重50～70 g。購于中國科學院上海分院實驗動物中心，合格證號為SCXX(滬)2003-0003，置實驗動物中心層流實驗室飼養2 d，自由攝食、水，室溫25 ℃，相對濕度70%，12/12 h晝夜照明變化。

氯化鋰、匹魯卡品和溴化甲基東莨菪堿均購于Sigma；Trizol Reagent試劑購于Invitrogen；RT-PCR試劑盒購于Fermantas；caspase-3和caspase-12抗體購于US Biological，羊抗兔IgG及SABC試劑盒均購于上海晶美公司；目的基因及內參照均利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，然后經過BLAST匹配，由上海生工生物工程有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型的制作 隨機將實驗動物分為生理鹽水對照組(NS組)、驚厥持續狀態組(SC組)和依達拉奉組(ED組)3大組；每組再按時點隨機分4 h、12 h、24 h、48 h和72 h和5個亞組，每亞組13只。模型制作參照李光乾等[1]的方法并稍做改進，具體方法如下：SC組按127 mg/kg劑量腹腔注射氯化鋰，18 h后按1 mg/kg劑量腹腔注射硫酸阿托品以拮抗匹魯卡品外周膽堿能反應，30 min后按100 mg/kg劑量腹腔注射匹魯卡品。觀察SC組大鼠出現驚厥發作的行為學表現。大鼠驚厥按Racine分級，0級：無任何發作跡象；Ⅰ級：凝視、咀嚼和須動；Ⅱ級：點頭、濕狗樣抖動或搔抓；Ⅲ級：前肢陣攣抽搐；Ⅳ級：伴后肢站立的全身強直性發作；Ⅴ級：伴有站立并摔倒的全身強直-陣攣性發作。驚厥發作達Ⅳ～Ⅴ級，持續時間達30 min以上，驚厥緩解后狀態良好的大鼠為合格SC大鼠模型。當驚厥發作達30 min時，給予10%水合氯醛400 mg/kg、阿托品1 mg/kg腹腔注射，如不能緩解驚厥，可重復給予水合氯醛1～2次，直至驚止。ED組于驚厥前3 d予以ED腹腔注射(5 mg/kg)，每天1次，連續3 d，其它處理同SC組。NS組用生理鹽水代替氯化鋰及匹魯卡品，其它處理同SC組。

2.2 動物腦標本的采取及制作 采取水合氯醛(400 mg/kg)麻醉動物，斷頭處死。迅速剝離顱骨，完整取出腦組織，置于冰盤上，采用高溫(180 ℃)滅RNA酶的刀片和鑷子沿矢狀裂將腦組織切分；右側腦組織快速分離出海馬，放入去RNA 酶的EP 管中，迅速置于-80 ℃液氮中保存。將其左半球在距額極2 mm和距尾極1 mm處各切1刀，取中間段置4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h，脫水、石蠟包埋后，用振蕩切片機從視交叉處開始作冠狀連續切片，片厚5 μm。

2.3 半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測caspase-3和caspase-12 mRNA含量 取液氮保存的海馬標本，用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄反應按照試劑盒說明書進行操作。PCR反應用GAPDH作為內參照，caspase-3、caspase-12和內參照的引物序列見表1。PCR體系為：cDNA 3 μL，10×buffer 2.0 μL，MgCl21.2 μL，dNTP 0.5 μL，ddH2O 11.5 μL，Taq酶 0.2 μL，上、下游引物各0.8 μL，總反應體系為20 μL。各目的基因的PCR反應條件如下，caspase-3：94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環；caspase-12：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個循環；GAPDH：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，32個循環。各取4 μL PCR產物在1.67%瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠圖像成像分析系統下掃描，用Smart View軟件測定產物吸光度(absorbance,A)，用目的條帶產物A值與GAPDH產物A值之比表示組織中目的基因的mRNA相對含量。

表1 PCR各引物序列

2.4 免疫組織化學檢測海馬CA1區caspase-3和caspase-12的蛋白表達 免疫組織化學檢測海馬CA1區的caspase-3蛋白：60 ℃烤片60 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟15 min，乙醇梯度水化各5 min，檸檬酸高壓修復20 min，3% H2O2室溫10 min，正常兔血清室溫封閉10 min，caspase-3抗體(1∶25)4 ℃冰箱內過夜，生物素化IgG 37 ℃ 10 min，SABC 37 ℃ 10 min，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、中性樹脂封片；陰性對照組用PBS代替caspase-3抗體。海馬CA1區caspase-12蛋白的檸檬酸高壓修復時間為10 min，其余步驟同caspase-3；陰性對照組用PBS代替caspase-12抗體。每張切片隨機選擇5個高倍鏡下視野(×400)，應用Image-Pro Plus 圖像分析軟件測定陽性部位的積分吸光度(integral absorbance,IA)。

3 統計學處理

用SPSS 17.0統計軟件分析，所得數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組樣本均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用最小顯著性差異(least-significant difference，LSD)法，兩變量的相關采用Pearson等級相關分析法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 氯化鋰-匹魯卡品致幼年大鼠驚厥發作及驚厥潛伏期情況

從表2可以看出，SC組在腹腔注射匹魯卡品后(16.67±5.40) min成功誘導出Ⅳ級及以上SC的幼年大鼠各61只，其中Ⅴ級驚厥56只，Ⅴ級驚厥率為91.80%(56/61)；而ED組在腹腔注射PILO后(21.21±6.39) min有60只幼鼠誘發出Ⅳ級及以上的發作，其中Ⅴ級45只，Ⅴ級驚厥率為75.00%(45/60)。ED組Ⅴ級驚厥率較SC組低，差異有統計學意義(P<0.05)；且ED組驚厥潛伏期也較SC組明顯延長，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 ED組與SC組大鼠Ⅴ級驚厥率和平均驚厥潛伏期的比較

2 各組幼年大鼠海馬caspase-3的mRNA水平

NS組在驚厥后各時點海馬caspase-3 的mRNA表達無明顯變化。SC組除4 h外各亞組海馬caspase-3 的mRNA表達均較NS組顯著增高(P<0.05)，mRNA表達在SC后12 h開始升高，48 h達峰值，72 h顯著下降。ED組大鼠海馬caspase-3 mRNA的表達趨勢與SC組相似，但在24 h、48 h和72 h較SC組顯著降低(P<0.05)，見圖1、表3。

Figure 1.The mRNA expression of caspase-3 in the hippocampus of young rats at different time points shown by electrophoresis.

表3 各組幼年大鼠不同時點海馬caspase-3 mRNA灰度比值比較

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05，##P<0.01vsSC group.

3 各組幼年大鼠海馬區caspase-12 mRNA水平

結果顯示，SC組大鼠海馬在12 h～48 h各時點caspase-12 mRNA的表達均顯著高于NS組(P<0.05)，其表達在SC后12 h 開始顯著升高，24 h達峰值，48 h開始下降，于72 h迅速降至基線水平。ED組大鼠海馬caspase-12的 mRNA時間表達趨勢與SC組相似，在24 h達峰，但其在24 h和48 h caspase-12 mRNA的表達均顯著低于SC組(P<0.05)；但24 h caspase-12 mRNA的表達仍明顯高于NS組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2、表4。

Figure 2.The mRNA expression of caspase-12 in the hippocampus of young rats at different time points shown by electrophoresis.

表4 各組幼年大鼠不同時點海馬caspase-12 mRNA灰度值比較

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsSC group.

4 各組幼年大鼠海馬CA1區的caspase-3蛋白檢測結果

免疫組織化學法檢測結果顯示caspase-3定位于胞漿和胞膜，主要表達在神經元和神經膠質細胞。NS組各時點海馬CA1區可見極少量弱陽性細胞出現。SC組大鼠海馬在各時點有不同程度的棕黃色染色細胞表達，在驚厥后48 h有多量神經元出現強陽性染色。

SC組大鼠在驚厥后12 h caspase-3蛋白表達開始增高，于48 h達峰值，在SC后24 h、48 h和72 h表達水平與NS組比較有統計學差異(P<0.05)。而ED組大鼠海馬caspase-3 蛋白表達趨勢雖與SC組相似，亦在48 h達峰，但其峰值較SC組顯著降低(P<0.05)；但在48 h時點其CA1區蛋白A值仍均高于NS組(P<0.01)，見圖3、表5。

Figure 3.The protein expression of caspase-3 in hippocampal CA1 area at 48 h in young rats.

表5 各組幼年大鼠在SC后不同時點海馬CA1區caspase-3蛋白A值的比較

*P<0.05,**P<0.01vsNS group; #P<0.05vsSC group.

5 各組幼年大鼠海馬CA1區的caspase-12蛋白檢測結果

免疫組織化學法檢測結果顯示caspase-12蛋白主要表達在海馬神經元上，未活化的caspase-12蛋白主要定位于胞漿和胞膜，SC后12 h核表達增加，24 h大量神經元胞核強陽性黃染，48 h核黃染減輕，提示活化的caspase-12蛋白增加。

NS組caspase-12蛋白各時點有少量弱陽性表達細胞出現。SC組大鼠在驚厥后12～72 h海馬CA1區caspase-12蛋白表達均顯著高于NS組(P<0.01)，于驚厥后12 h顯著增加，24 h達高峰，48 h開始緩慢下降。ED組高峰平緩，各時點caspase-12蛋白水平均低于SC組，24～72 h時點caspase-12蛋白水平明顯低于SC組(P<0.05)；但在12 h～48 h時點caspase-12蛋白表達仍顯著高于NS組(P<0.05)，見圖4、表6。

Figure 4.The protein expression of caspase-12 in hippocampal CA1 area at 24 h in young rats.

表6 各組幼年大鼠不同時點海馬CA1區caspase-12蛋白A值的比較

*P<0.05,**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsSC group.

討 論

既往SC后腦損傷機制研究的重點一直集中在死亡受體活化和線粒體損傷這2條經典的細胞凋亡途徑上，近年發現ERS反應性凋亡途徑[1]是一條新的凋亡途徑。適當的ERS有利于減輕內質網負荷，使其恢復穩態，增強細胞抵抗應激的能力；當應激持續存在、內質網穩態無法得到恢復時，引起內質網相關性細胞凋亡。Caspases-12 主要表達于內質網，是ERS介導凋亡的關鍵效應酶，可能處于內質網膜蛋白IRE1、ATF6和PERK通路的共同下游[5]。有關腦缺血的研究已證實，由caspase-12 介導的ERS反應性細胞凋亡途徑在缺血性腦損傷方面有重要作用。反復驚厥或SC導致的大腦病理生理狀態具有誘導ERS的條件。但過度的ERS會導致caspase-12的激活和釋放[6]。本研究結果顯示，SC組幼年大鼠海馬caspase-12 mRNA的水平在驚厥后12 h即迅速升高，24 h達峰，在48 h開始緩慢下降；通過免疫組織化學檢測也發現，SC組海馬CA1區神經元在24 h后核棕黃色染色明顯增加，提示caspase-12 活化后可以轉位到核內起作用。但caspase-12 蛋白于驚厥后48 h達高峰，72 h才顯著下降，與caspase-12 mRNA的表達不同步，我們認為這種高峰不同步可能與早期蛋白翻譯抑制或不平衡有關。

Caspase-3 可能是整個凋亡級聯反應的中心環節之一，在幾乎所有的凋亡中被最后活化的caspase 分子，被認為是凋亡的最終效應蛋白[7]。生理情況下，caspase-3 以無活性的酶原(pro-caspase-3)形式存在于哺乳動物多種組織和細胞內。在細胞凋亡過程中，多種刺激因素的啟動信號均可激活caspase-3，活化的caspase-3又進一步切割不同的底物，導致蛋白級聯切割放大，最終使細胞發生不可逆的凋亡，故常將caspase-3 的活化程度作為判斷細胞凋亡嚴重性的可靠指標之一[8]。近年來，有研究者在紅藻酸所致大鼠癲癇模型中，發現caspase-3在驚厥發作致神經元損傷過程中具有關鍵作用[8]；而應用caspase-3特異性抑制劑后，海馬組織神經元凋亡明顯減少[9]，從而證實caspase-3在驚厥發作引起的神經元死亡機制中確實發揮了重要作用。本實驗結果顯示，驚厥后12 h 幼年大鼠海馬caspase-3的 mRNA和蛋白表達開始升高，24～48 h達高峰，72 h緩慢下降，提示匹魯卡品誘導的SC大鼠海馬caspase-3表達的變化可能在驚厥后海馬損傷過程中起重要作用。

從結構和功能上分，caspase-12 與caspase-3 共同被認為在是凋亡酶家族中的凋亡效應酶，但兩者之間的關系卻仍不十分統一。許多研究表明，caspase-12 在ERS反應凋亡途徑中位于凋亡級聯的始動點，活化的caspase-12 作為ERS反應性凋亡的始動因子激活caspase-9，使其表達上調，進一步激活caspase-3，最終由caspase-3執行凋亡[5, 10-11]，提示ERS相關性凋亡與線粒體損傷途徑可能存在一定的交聯。但Biagioli等[12]在用cadmium誘導細胞ERS介導細胞凋亡的研究中發現，caspase-12和caspase-3 激活的時間相近，推測線粒體和內質網凋亡途徑在激活時間上是平行的。Takai等[13]最近在雌性生殖細胞凋亡機制研究中發現，caspase-12具有相對獨立性，缺乏caspase-3和caspase-12的狀態下，其激活也能導致細胞凋亡。本研究結果雖然顯示caspase-12與caspase-3存在顯著正相關關系，但它們隨時間變化趨勢基本同步，故并不排除caspase-12誘導的ERS反應性凋亡途徑具有相對獨立性的可能。

ED是一種新型的自由基清除劑和抗氧化劑，分子量小，具有親脂基團，其血腦屏障穿透率約高達60%，可在腦內達到有效的治療濃度；且其在體內以陰離子形式存在，脂溶性高，容易穿過血腦屏障，故起效迅速。大量的實驗研究表明，ED通過捕獲羥自由基、抑制脂質過氧化作用、抑制腦細胞(血管內皮細胞、神經細胞)的過氧化作用，減輕腦水腫。故該藥尤其對缺血性腦損傷具有很強的腦保護作用[14]。本研究發現，ED組Ⅴ級驚厥率較SC組低，且ED組驚厥潛伏期也較SC組明顯延長，提示ED對幼年大鼠驚厥性腦損傷可能具有早期保護作用。ED預處理組可在SC后72 h內各時點明顯降低大鼠海馬caspase-12 mRNA和蛋白的水平，且此作用在24 h～48 h最強，并延續到本實驗終點72 h。但本研究也發現其并不能完全逆轉或者抑制caspase-12在SC后的升高。以上均提示依達拉奉可以調節SC誘導的ERS功能，部分抑制后期由caspase-12介導的ERS反應性凋亡信號通路的激活。該通路也可能是依達拉奉除高效清除氧自由基等機制以外的新作用位點。

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Effects of edaravone on expression of caspase-3 and caspase-12 in juvenile rat hippocampus after status convulsion

HUANG Hong-yu, LI Guang-qian

(DepartmentofPediatricNeurology,HangzhouChildren’sHospital,Hangzhou310014,China.E-mail:lgqwz@aliyun.com)

AIM: To investigate the effect of edaravone (ED) on the expression of caspase-3 and caspase-12 in the juvenile rat hippocampus after status convulsion (SC).METHODS: Juvenile male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal saline (NS) control group, SC group and ED treatment group. The rats in each group were further divided into 5 subgroups according to different time points. The rats in SC group were kindled into epilepsy by lithium-pilocarpine chemical method. The protein expression of caspase-3 and caspase-12 was determined by immunohistochemistry methods. The mRNA expression of caspase-3 and caspase-12 was detected by RT-PCR. RESULTS: (1) TheIAvalue of caspase-3 positive cells in 24～72 h SC group increased compared with NS group. With ED intervention, theIAvalue of caspase-3 positive cells decreased as compared with 48～72 h SC group. The results of RT-PCR showed that the mRNA expression of caspase-3 was similar to the changes of protein. (2) The results of immunohistochemistry showed that the IA value of caspase-12 positive cells in 12～72 h SC group increased compared with NS group. With ED intervention, theIAvalue of caspase-12 positive cells decreased as compared with 24～72 h SC group. The results of RT-PCR showed that the mRNA expression of caspase-12 was similar to the changes of protein. (3) In ED group, Ⅴ grade convulsion was lower than that in SC group, and the latent period of seizures in ED group was significantly longer than that in SC group. CONCLUSION: Edaravone inhibits the expression of caspase-3 and caspase-12 in pilocarpine-induced seizures in rat hippocampus, suggesting that edaravone has protective effect against the damage caused by status convulsion.

Caspase-3; caspase-12; Status convulsion; Edaravone

1000- 4718(2015)03- 0562- 07

2014- 08- 25

2014- 11- 20

△通訊作者 Tel： 0571-85465414； E-mail： lgqwz@aliyun.com

R363； R729

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.032