參松養心膠囊對心梗后心肌的保護作用及機制研究

劉自強，王 晞，黨 松

(武漢大學人民醫院心內科，湖北 武漢 430060)

參松養心膠囊對心梗后心肌的保護作用及機制研究

劉自強，王 晞，黨 松

(武漢大學人民醫院心內科，湖北 武漢 430060)

目的 探討參松養心膠囊(SSYX)對心肌梗死后心律失常發生和心功能不全的影響及其作用機制。方法將40只新西蘭大耳白兔行冠狀動脈前降支結扎術后隨機分為正常對照組(Control組)10只、心梗組(MI組)10只、心梗+胺碘酮組(MI+A組，0.4 g·kg-1·d-1)10只、心梗+參松組(MI+S組，0.5 g·kg-1·d-1)10只。正常對照組開胸后在冠狀動脈下穿線，但不結扎。術后，分別以普食、普食+胺碘酮粉末、普食+參松養心膠囊原粉喂食。8周后將家兔處死，在心梗周邊區取材，檢測各組白兔縫隙連接蛋白43(CX43)、鈉鈣交換體(NCX)和蘭尼堿受體蛋白(RyR2)mRNA的相對表達量。結果與Control組比較，MI組CX43、RyR2 mRNA相對表達量顯著下降(P＜0.05)，而NCX mRNA相對表達量雖然有所下降，但其差異無統計學意義(P＞0.05)；與MI組比較，MI+A組CX43、RyR2 mRNA相對表達量顯著升高(P＜0.05)，MI+S組CX43、NCX、RyR2 mRNA的相對表達量也顯著升高(P＜0.05)；與MI+A組比較，MI+S組CX43、NCX mRNA的相對表達量均顯著升高(P＜0.05)。結論參松養心膠囊可以改善心肌梗死后心律失常以及心功能不全，其機制可能與調控各鈣離子通道的開放，抑制鈣超載有關。

參松養心膠囊；心肌梗死；鈣通道；縫隙連接蛋白43；鈉鈣交換體；蘭尼堿受體蛋白

心肌梗死是在冠脈病變的基礎上發生冠脈血供急劇減少或中斷，使相應心肌嚴重而持久地急性缺血，導致心肌壞死。75%～95%的患者伴有心律失常，嚴重者甚至發生室顫，導致猝死。現在臨床上常用的許多抗心律失常西藥雖然能控制心律失常的發生，改善心律失常的癥狀，但是往往導致病死率以及死亡率的升高[1]，因此，如何在控制心律失常的同時又減少病死率，改善患者的預后，成為臨床上治療心律失常的一個難題。參松養心膠囊由五味子、麥冬、丹參、黃連等多種中藥組成的復方劑，在體動物模型已證實，參松養心膠囊可以通過抑制多種離子通道來預防因化學毒物或缺血再灌注引起的心律失常，并且可以通過調控各種離子通道蛋白來改善心功能，減少病死率及死亡率，并且不會出現致心律失常的副作用[2-3]，但是具體是哪些離子通道影響的且作用機制如何，尚未可知。目前研究表明鈣離子通道可能在預防心梗后的心律失常中發揮了重要作用，為此，筆者通過建立心梗模型研究參松養心膠囊對縫隙連接蛋白43(CX43)、鈉鈣交換體(NCX)、蘭尼堿受體蛋白(RyR2) mRNA水平的影響并探討這些離子通道改善心律失常的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭大耳白兔(武漢生物研究所提供，體重2.2～2.5 kg)；離心機(Heal Force)型號：臺式高速冷凍離心機Neofuge 15R；PCR儀(Hangzhou Bioer Teechnology Co，LTD)型號：Life express Thermal Cycler；SLAN熒光定量PCR檢測系統(上海宏石醫療科技有限公司)；超凈工作臺(蘇凈安泰)型號：SW-CJ-1FD；Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies)目錄號：15596-026；ReverTra Ace-α-目錄號：K-1622；TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix目錄號：QPS-201；離心管、TIP頭(Axygen Biosciences)；青霉素(華北制藥股份有限公司生產)、三氯甲烷國藥集團(化學試劑有限公司)、異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司)、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；參松養心原粉(石家莊以嶺藥業股份有限公司)；引物(Invitrogen Biotechnology Co，LTD)。

1.2 動物模型的制作及分組 取40只新西蘭大耳白兔，隨機分為正常對照(Control)組、MI組、MI+A組及MI+S組，每組10只。動物稱重后以戊巴比妥(40 mg/kg)耳緣靜脈麻醉，并經前胸暴露心臟，結扎冠狀動脈左前降支。以心電監護顯示Ⅰ、Ⅱ、aVL導聯ST段抬高0.2 mV為手術成功的標準，術后注射40萬U青霉素。分別以普食(Control組、MI組)、普食+胺碘酮粉(MI+A組，胺碘酮粉劑量0.4 g·kg-1·d-1)及普食+參松養心原粉(MI+S組，參松養心原粉劑量0.5 g·kg-1·d-1)喂養8周。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)

1.3.1 總RNA的提取 取100 mg左室心肌梗死周邊區組織置勻漿器中，加入1 ml的Trizol，冰上勻漿，使核蛋白充分解離；并經氯仿分離，異丙醇沉淀，乙醇洗滌后，離心，棄上清，最終加入雙蒸水溶解，并用紫外分光光度法分析RNA的純度與濃度。

1.3.2 反轉錄 根據總RNA的含量，以其中的mRNA為模板，利用逆轉錄酶反轉錄合成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增。

1.3.3 實時熒光定量PCR 按照合成說明，在引物中加入ddH2O，制成2.5 μmol/L溶液，引物序列見附表1。在cDNA中加入相關引物，并按照RT-PCR試劑盒(TOYOBO)說明，以95℃預變性1 min后進入PCR循環，95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，循環40次。反應完成后計算機自動計算CT值，CT值定義為：每個反映管內的熒光信號達到設定的閾值所經歷的循環次數，即從基線到指數增長所經歷的循環次數。

表1 各目的基因及引物的相關信息表

1.4 統計學方法 應用SPSS21統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

心梗模型制備過程中，3只新西蘭大耳白兔由于意外情況出現猝死(2只死于室顫，1只原因未明)，剩余37只(Control組10只，MI組9只，MI+A組9只，MI+S組9只)均制備心梗模型成功，且順利完成各指標的檢測。檢測結果如下：與Control組比較，MI組CX43、RYR2 mRNA相對表達量顯著下降(P＜0.05)，而NCX mRNA相對表達量雖然有所下降，但其差異無統計學意義(P＞0.05)。與MI組比較，MI+A組CX43、RYR2 mRNA相對表達量顯著升高(P＜0.05)， NCX mRNA的相對表達量也有所升高，但其差異無統計學意義(P＞0.05)；MI+S組CX43、NCX、RYR2 mRNA的相對表達量皆顯著升高(P＜0.05)。與MI+A組比較，MI+S組CX43、NCX mRNA的相對表達量顯著升高(P＜0.05)，RYR2 mRNA的相對表達量也有所升高，但其差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 藥物干預8周后CX43、NCX、RYR2、mRNA的表達(±s)

表2 藥物干預8周后CX43、NCX、RYR2、mRNA的表達(±s)

注：與Control組比較，aP＜0.05；與MI組比較，bP＜0.05；與MI+A組比較，cP＜0.05。

組別Control組MI組MI+A組MI+S組只數10 9 9 9 CX43 2.4090±0.3643 2.0419±0.1485a2.1508±0.1796b2.4914±0.0971bcNCX 2.6311±0.5136 2.2698±0.1781 2.4448±0.0949 2.8254±0.1526bcRYR2 2.5670±0.5124 2.1587±0.1846a2.5403±0.1462b2.7542±0.1334b

3 討 論

心梗后心律失常是心源性死亡的主要原因之一，而鈣超載是心梗后心律失常發生和維持的重要原因。鈣超載可以使心肌部分去極化，縮短動作電位時程，誘發短暫后除極，引起缺血性心律失常，而且Ca2+電流任何微小的變化即可導致其他離子電流改變，造成心肌電活動異常，抑制鈣超載可以明顯減小心梗后心律失常的發生率[4-5]，CX43、NCX、RYR2 mRNA可編碼鈣循環相關的通道蛋白，調控細胞內外鈣離子的轉運，鈣離子轉運的異常是鈣超載發生的主要病理生理機制，故CX43、NCX、RYR2 mRNA的表達水平可以一定程度反應鈣超載的狀態。參松養心膠囊是近年來新發現的中成藥，可以明顯減弱心梗后心律失常的發生，并改善心功能[3，6]，究其機制仍不明確，而本文發現，參松養心膠囊可明顯增加CX43、NCX、RYR2mRNA的表達水平，提示參松養心膠囊的心肌保護作用可能與抑制鈣超載有關。

Cx43是縫隙連接蛋白，主要存在于心房和心室中，參與心肌細胞間信號傳導。有研究發現，心肌梗死CX43蛋白表達減少或降解增多，導致縫隙連接減少，電傳導減慢，異向性增加，動作電位離散幅度增加，且心梗后Cx43蛋白各部位重排程度不一，心肌電沖動經過這些部位時傳導速度會出現不均一性增高，這些都是形成折返和傳導阻滯的基礎，進一步誘發心律失常[4，7]。此外，Cx43蛋白的磷酸化、去磷酸化以及分布均可影響縫隙連接的導電性，誘發心律失常[8]。研究顯示，心肌缺血可導致Cx43脫磷酸化，縫隙連接通道的開放，進而Ca2+內流增加，引起鈣超載，加重心律失常和心肌細胞壞死[10]。同時有研究證實，Cx43可以通過調節活性氧(ROS)生成，穩定線粒體膜，抑制鈣超載，減輕缺血心肌細胞的凋亡和壞死，改善心功能[11-12]。本研究發現，參松養心膠囊可上調CX43表達，抑制鈣超載發生，進而抑制心律失常保護心肌。

NCX是維持細胞內Ca2+濃度穩定的主要通路之一正常生理狀態下，NCX主要在心肌細胞復極化后期，介導前向模式，與鈣泵一起，將胞質內的鈣離子轉運到細胞外或肌質網內，從而降低胞漿內Ca2+濃度，促使細胞舒張[13-14]；膜去極化或胞質中Na+濃度較高時，NCX可以介導反向模式，調節細胞的生理功能[15]。而在缺血、缺氧等病理條件[16]下NCX也能夠介導反向模式的Ca2+內流，引起胞內鈣超載，誘發細胞凋亡與壞死[17]。本研究發現，與MI組比較，參松養心膠囊可明顯增加心梗周邊區NCX mRNA水平，胺碘酮組也表現了增高趨勢但未達統計學意義，故筆者推測參松養心膠囊可能是介導了NCX的前向模式抑制了鈣超載，從而抑制心律失常發生保護心功能，但其機制及正確性仍需進一步研究證實。

RYR2是心肌肌漿網中的鈣釋放通道，其表達下調和功能異常造成的Ca2+滲漏是許多心律失常疾病以及心力衰竭疾病的發病基礎。生理狀態下，FKBP12.6與RyR2相結合，阻止Ca2+通道的開放，減少鈣滲漏。心梗后鈣滲漏增多，可能與高腎上腺素水平激活PKA，RyR2被過度磷酸化，導致FKBP12.6解離，舒張期通道開放頻率增加，肌漿網中Ca2+泄漏增多[18]，進而引起延遲后除極(DAD)有關，而FKBP12.6缺失小鼠的心房肌細胞中Ca2+的泄漏及房顫發生的傾向性增加則支持該觀點[19]。也可能與CaMKⅡ被激活及RyR2 Ser2815磷酸化增多有關，而RyR2-S2814A基因工程小鼠對房顫的保護作用也支持該觀點[21]。心梗患者RYR2 mRNA的表達量降低，RYR2功能抑制和數量減少使肌漿網鈣釋放不足，心肌收縮力下降[6]，同時，Ca2+泄露使肌漿網中鈣儲存下降，不能釋放足夠的Ca2+，心臟收縮功能下降。研究表明，參松養心膠囊可以提高RYR2的表達水平，減少鈣滲漏，抑制鈣超載，從而減少心律失常的發生和改善心功能。

綜上所述，參松養心膠囊對各鈣離子通道的綜合作用是抑制鈣超載，降低心肌細胞的除極幅度，延長動作電位時程和有效不應期，這可能是其抗心律失常作用的主要機制之一。同時減輕鈣超載對心肌細胞的損害，增強心肌收縮力，從而改善了心功能。簡言之，參松養心膠囊可以抑制鈣超載，對抗心律失常，增強心肌收縮力，起到保護心肌的作用。

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Myocardial protective effects of shensongyangxin capsule after myocardial infarction and the possible mechanisms.

LIU Zi-qiang,WANG Xi,DANG Song.Department of Cardiology,Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of shensongyangxin capsule(SSYX)on arrhythmia and cardiac insufficiency after myocardial infarction(MI)in rabbits.MethodsForty New Zealand White rabbits were randomly assigned into control group,MI group,MI+amiodarone group(MI+A group,with the dose of amiodarone at 0.4 g·kg-1·d-1)and MI+SSYX group(MI+S group,with the dose of SSYX at 0.5 g·kg-1·d-1)after successful establishment of model of MI,each with 10 rabbits.The control group applied stitches at coronary artery without ligation.The other three groups applied routine food,routine food+amiodarone,routine food+SSYX after surgery,respectively.After eight weeks,ryanodine receptor 2(RyR2),Connexin43(CX43),sodium-calcium exchanger(NCX)mRNA expression in peri-infarcted area were examined.ResultsCompared with control group,CX43,RyR2 mRNA relative expression significantly decreased in MI group(P＜0.05),but NCX mRNA relative expression showed slight decrease without statistically significant difference(P＞0.05).Compared with MI group,CX43,RyR2 mRNA relative expression significantly increased in MI+Agroup(bothP＜0.05),and CX43,NCX,RyR2 mRNArelative expression significantly increased in MI+ S group(allP＜0.05).Compared with MI+A group,CX43,NCX,mRNA relative expression significantly increased in MI+S group(allP＜0.05).ConclusionSSYX can improve arrhythmia and cardiac dysfunction after myocardial infarction,which may be related to the open of calcium ion channels and the inhibition of calcium overload.

Shensongyangxin(SSYX);Myocardial infarction(MI);Calcium ion channel;Connexin43 (CX43);Sodium-calcium exchanger(NCX);Ryanodine receptor 2(RyR2)

R542.2+2

A

1003—6350（2015）24—3589—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.24.1299

2015-04-23)

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(編號：2012CB518604)

王 晞。E-mail：xiwangwhu@163.com