結核分枝桿菌T細胞斑點試驗對結核性胸腔積液診斷價值的研究

許雪成，茅利明

(1.紹興縣柯橋街道社區衛生服務中心檢驗科，浙江紹興312030; 2.紹興縣中心醫院檢驗科，浙江紹興312030)

結核分枝桿菌T細胞斑點試驗對結核性胸腔積液診斷價值的研究

許雪成1，茅利明2

(1.紹興縣柯橋街道社區衛生服務中心檢驗科，浙江紹興312030; 2.紹興縣中心醫院檢驗科，浙江紹興312030)

目的探討結核分枝桿菌(MTB)T細胞斑點試驗(T－SPOT)在疑似MTB感染伴胸腔積液患者快速診斷中的應用價值。方法疑似MTB感染伴胸腔積液患者124例，應用T－SPOT檢測外周血淋巴細胞對MTB特異性分泌蛋白EAST－6和CFP－10的免疫反應。利用MTB DNA法檢測胸腔積液中的MTB，同時用免疫金標法檢測血清MTB抗體，并進行統計學分析。結果124例疑似患者經過痰和胸腹水抗酸染色鏡檢、痰液和胸腹水MTB培養、結核菌素皮膚試驗、MTB DNA和MTB抗體等試驗確診結核病患者44例，陽性檢出率為35.5%。T－SPOT的陽性檢出率為33.06%(41/124)，MTB DNA的陽性檢出率為14.52%(18/124)，血清MTB抗體的陽性檢出率為9.68%(12/124)。對已確診的44例結核病患者進行數據分析，T－SPOT、MTB DNA和血清MTB抗體的準確率分別為86.36%(38/44)、27.27%(12/44)和18.18%(8/44)。T－SPOT的陽性檢出率和結核診斷的準確率均顯著高于其它2種方法(P＜0.05)。T－SPOT對疑似MTB感染的胸腔積液患者診斷的陽性預測值為92.68%，陰性預測值為92.77%。結論T－SPOT對疑似MTB感染伴胸腔積液患者的診斷具有快速、高敏感性和高特異性的優點，優于MTB DNA和血清MTB抗體試驗，可以作為一種新的技術應用于人體MTB感染的診斷。

T細胞試驗;DNA;抗體;結核分枝桿菌;胸腔積液

胸腔積液是臨床最常見的癥候群，可由惡性腫瘤、肺結核和胸膜結核等疾病引起。患者呈進行性加重的胸痛和呼吸困難，伴胸水(可為血性)，增長速度快，患者的生命受到嚴重影響。惡性腫瘤引起的胸腔積液可以由腫瘤標志物的血清學檢查和胸水查找癌細胞的病理學檢查等一系列檢查快速確診。而肺結核或胸膜結核引起的胸腔積液，因為抗酸染色鏡檢、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)培養和血清MTB抗體的陽性檢出率低，MTB培養方法存在敏感性低，檢測周期長等問題，導致臨床診斷困難。MTB T細胞斑點試驗(T cells spot test，T－SPOT)是檢測外周血分泌γ干擾素(interferon gamma，IFN－γ)的T淋巴細胞數量的試驗，近幾年在歐美國家已被證實為在MTB感染檢測中具有較好的特異性和敏感性，被廣泛用于臨床常規檢測[1]。本研究擬探討外周血T－SPOT在明確胸腔積液性質(結核性)的應用價值。

材料和方法

一、研究對象

選擇2012年2月至2013年6月因患有胸腔積液而在紹興縣中心醫院呼吸內科等相關科室住院的患者。入選標準:咳嗽，呼吸急促、困難，胸部X片和計算機斷層掃描檢查提示伴有中等量胸腔積液的患者。排除標準:(1)入院前，已經實施抗結核治療＞1個月者;(2)合并糖尿病以及嚴重的肝功能、腎功能異?；蛐墓δ懿蝗颊?(3)人類免疫缺陷病毒陽性患者。根據上述標準共入選患者124例，其中男80例，女44例，中位年齡59.4 (36～75)歲。均符合2008年8月1日實施的中華人民共和國衛生部發布的中華人民共和國衛生行業標準。

二、方法

1.標本收集住院患者均在清晨安靜狀態下采集血液標本。檢測T－SPOT所需要的標本為:成人抽全血量為4～5 mL，免疫力低或白細胞少的患者抽取8～10 mL，置于肝素抗凝管，充分混勻。檢測MTB抗體的血清標本為2 mL全血并置于生化管，靜置后在1 500×g離心力下離心5 min分離血清標本備用。MTB DNA法需采集胸腔積液，1 500×g離心取沉渣備用。

2.T－SPOT使用英國Oxford Immunotec公司生產的試劑盒。采集患者外周血并分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PMBC)，用無血清培養液重懸細胞并調節細胞濃度到2.5×106/mL。在陰性對照、陽性對照、A和B孔中分別加入50 μL的無血清培養液、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)對照、EAST－6和CFP－10。然后每孔加入100 μL的2.5×106/mL的標準細胞溶液，37℃5%CO2環境下孵育16～20 h。磷酸鹽緩沖液洗板4次后加入酶結合物溶液于每孔，2～8℃孵育1 h。洗板4次后拍干，加入顯色劑，室溫孵育10 min。用蒸餾水洗滌4次后充分拍干。用計算機輔助成像技術分析系統進行斑點的閱讀與統計。結果判斷按照試劑盒說明書進行，即當EAST－6或CFP－10測試孔中的任一個達到以下標準就判斷為陽性:(1)陰性對照孔點數0～5，測試孔斑點數－陰性對照孔斑點數≥6;(2)若陰性對照孔斑點數≥6，測試孔斑點數應≥2倍陰性對照孔斑點數。

3.MTB DNA檢測胸腔積液沉渣抽提MTB DNA，檢測試劑盒由廣東達安基因有限公司提供，試劑盒在有效期內。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀為美國ABI公司的7300實時熒光定量PCR儀。

4.血清MTB抗體檢測檢測所用試劑為上海奧普生物醫藥公司提供的MTB抗體膠體金法診斷試劑盒，實驗原理為斑點免疫金滲濾法。

5.其它確診試驗用于確診MTB感染的其它試驗包括胸水抗酸染色鏡檢、胸水MTB培養和結核菌素皮膚試驗等，均按《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)進行。

三、統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，2種方法的陽性率比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結果

一、124例疑似MTB 感染的胸腔積液患者T－SPOT、MTB DNA的陽性率及準確率比較

124例疑似MTB感染的胸腔積液患者用T－SPOT和MTB DNA檢測，兩者同時陽性16例，T－SPOT陽性而MTB DNA陰性25例，MTB DNA陽性而T－SPOT陰性2例，T－SPOT的陽性檢出率為33.06%，MTB DNA的陽性檢出率為14.52%，2種方法陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=11.7，P＜0.05)。見表1。

44例確診MTB感染的胸腔積液患者用T－SPOT和MTB DNA檢測，兩者同時陽性8例，T－SPOT陽性而MTB DNA陰性30例，MTB DNA陽性而T－SPOT陰性4例，T－SPOT的準確率為86.36%，MTB DNA的準確率為27.27%，2種方法的準確率比較，差異有統計學意義(χ2=5.436，P＜0.05)。見表2。

二、124例疑似MTB感染的胸腔積液患者T－SPOT、血清MTB抗體的陽性率及準確率比較

124例疑似MTB感染的胸腔積液患者用T－SPOT和MTB抗體檢測，兩者同時陽性8例，TSPOT陽性而MTB抗體陰性33例，MTB抗體陽性而T－SPOT陰性4例，T－SPOT的陽性檢出率為33.06%，MTB抗體的陽性檢出率為9.68%，2種方法的陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2= 20.1，P＜0.05)。見表3。

44例確診MTB感染的胸腔積液患者用T－SPOT和MTB抗體檢測，兩者同時陽性5例，T－SPOT陽性而MTB抗體陰性33例，MTB抗體陽性而T－SPOT陰性3例，T－SPOT的準確率為86.36%，MTB抗體的準確率為18.18%，2種方法的準確率比較，差異有統計學意義(χ2= 4.728，P＜0.05)。見表4。

三、124例疑似MTB感染的胸腔積液患者TSPOT、MTB DNA及MTB抗體檢測

結果見表5。

討論

結核病是一種嚴重危害人類健康的傳染病，傳統的檢測方法如痰涂片抗酸染色鏡檢、痰液MTB培養、結合菌素皮膚試驗等都存在著敏感性低、檢測周期長等問題。因此結核病的早期快速診斷與治療已成為制約結核病控制的關鍵因素。隨著科技發展，近年來發展起來的以T細胞免疫應答為基礎的IFN－γ釋放試驗(interferon gamma release assays，IGRAs)被廣泛應用于歐美國家的各級醫療機構，列入結核病診療指南[2]。IGRAs的原理為:機體首次感染MTB后，體內產生的記憶T淋巴細胞將長期存活于人體內。當機體再次受到MTB感染時，記憶T細胞迅速增殖為效應T細胞，分泌IFN－γ以及其它一些細胞因子刺激T淋巴細胞增殖，同時激活巨噬細胞。T－SPOT利用酶聯免疫斑點技術檢測MTB特異性的抗原EAST－6和CFP－10[3]。由于IGRAs技術使用的抗原來自于MTB基因組具有而卡介苗缺失的RD區域(region of difference)，所以能夠較好地區別卡介苗接種和MTB感染，具有較低的假陽性率，特異性較結核菌素試驗有較大提高。從表5中的統計數據我們可以知道，T－SPOT在結核病的診斷中敏感性為86.36%，特異性為96.25%。而據DIEL等[4]的Meta數據分析報道，T－SPOT診斷肺結核的敏感性為85%～90%。本研究數據與國內外相關研究報道近似。

由表1可知，124例疑似MTB感染的胸腔積液患者用T－SPOT和MTB DNA檢測，兩者同時陽性者16例，T－SPOT單獨檢測陽性者33例，MTB DNA單獨檢測陽性者2例，2種方法陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=11.7，P＜0.05)。而同樣根據表3可知，對于T－SPOT和MTB抗體的陽性率比較，兩者同時陽性8例，MTB抗體單獨檢測陽性4例，2種方法陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=20.1，P＜0.05)。同時，124例疑似MTB感染的胸腔積液患者經過系統痰涂片抗酸染色鏡檢、胸水涂片抗酸染色鏡檢和胸水MTB培養、結核菌素皮膚試驗、MTB DNA和MTB抗體等試驗確診患結核感染44例，陽性率為35.5%。T－SPOT對結核病的診斷準確率為86.36%，且具有較好的特異性，與參考文獻[5]一致。本研究中44例確診的結核病患者中，按照T－SPOT檢測出41例，剩余3例陰性患者，除了試劑本身敏感性所限外，也有可能是實驗操作過程中PMBC提取丟失造成的假陰性。此外，T－SPOT還受諸多因素的影響，如年齡、營養不良、化療和其它傳染性疾病等[6]。

綜上所述，T－SPOT在診斷MTB感染的胸腔積液患者中具有快速、敏感性較高的優點，可以與其它診斷方法聯合應用提高結核病診斷的準確性，對于臨床上快速鑒別診斷胸腔積液患者是否為MTB感染具有重要的價值，而且其不受卡介菌和其它分枝桿菌的影響。因此，T－SPOT作為一種新的診斷技術，在結核病的快速臨床診斷中具有較好的應用價值。但由于目前該試驗的費用比較高，在一定程度上限制了該技術的推廣。相信隨著國產替代試劑的開發，結核病的實驗室診斷會達到一個新的層面。

[1]LAVLANI A.Diagnosing tuberculosis infection in 21st century:new tools to tackle an old enemy[J].Chest，2007，131(6):1898－1906.

[2]BRODIE D，LEDERER DJ，GALLARDO JS，et al.Use of interferon－gamma release assay to diagnose latent tuberculosis infection in foreign－born patients[J].Chest，2008，134(4):869－874.

[3]MAZUREK GH，JEREB J，VERNON A，et al.Updated guidelines for using interferon gamma release assays to detect Mycobacterium tuberculosis infection－United States，2010[J].MMWR Recomm Rep，2010，59(RR－5):1－25.

[4]DIEL R，LODDENKAMPER R，NIENHAUS A，et al.Evidence－based comparison of commercial interferongamma release assays for detecting active TB:a meta analysis[J].Chest，2010，137(4):952－968.

[5]王森，陳嘉臻，張舒，等.血清學診斷方法及T細胞斑點試驗在結核病診斷中的應用[J].中華臨床感染病雜志，2013，6(1):13－17.

[6]DIELR，LODDENKEMPERR，MEYWALDWALTER K，et al.Comparative performance of tuberculin skin test，Quanti－FERON－TB－Gold in tube assay，and T－SPOT.TB test in contact investigations for tuberculosis[J].Chest，2009，135(4):1010－1018.

Study on the diagnostic significance of T cells spot test in Mycobacterium tuberculosis infected patients with pleural effusion

XU Xuecheng1，MAO Liming2.(1.Department of Clinical Laboratory，Keqiao Community Health Center，Zhejiang Shaoxing 312030，China;2.Department of Clinical Laboratory，Shaoxing County Central Hospital，Zhejiang Shaoxing 312030，China)

ObjectiveTo investigate the application significance of Mycobacterium tuberculosis(MTB)T cells spot test(T－SPOT)in the rapid diagnosis for suspected MTB infected patients with pleural effusion.MethodsThe 124 patients with pleural effusion which were suspected as having suspected MTB infection were enrolled.T－SPOT was used to detect the immune response of peripheral blood lymphocyte against MTB special secreted protein EAST－6 and CFP－10.The MTB DNA method was used to detect MTB in pleural effusion，meanwhile serum anti－MTB antibody was detected by immuno－gold filtration assay，and the results were analyzed statistically.ResultsThe 44 of 124 cases were diagnosed as tuberculosis by sputum，pleural effusion and ascites smear test，sputum，pleural effusion and ascites MTB culture，tuberculin test，MTB DNA method and anti－MTB antibody test，and the positive rate was 35.5%.The positive rate of T－SPOT in the 124 patients with pleural effusion was 33.06%(41/124).The positive rate of MTB DNA method was 14.52%(18/124)，and that of anti－MTB antibody test was 9.68%(12/124).Among the 44 confirmed tuberculosis patients，T－SPOT had the consistency rate of 86.36%(38/44)，while the consistency rates of MTB DNA method and anti－MTB antibody test were 27.27%(12/44)and 18.18%(8/44)，respectively.The positive rate and consistency rate of T－SPOT were significantly higher than those of the others(P＜0.05).The positive and negative predictive values of T－SPOT in suspected MTB infected patients with pleural effusion were 92.68%and 92.77%，respectively.ConclusionsT－SPOT is fast，sensitive and specific to diagnose the suspected MTB infected patients with pleural effusion.T－SPOT is better than MTB DNA method and anti－MTB antibody test.T－SPOT can become a new diagnostic method to be applied in the diagnosis of MTB infection.

T cells spot test;DNA;Antibody;Mycobacterium tuberculosis;Pleural effusion

1673－8640(2015)03－0254－04

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.013

2014－02－10)

(本文編輯:姜敏)

許雪成，男，1977年生，主管技師，主要從事臨床檢驗工作。