采用冷凍干燥工藝制備地區性凝血因子室間調查品的初步研究

宋穎，戴菁，王青，丁秋蘭，王學鋒

(1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海200025;2.上海市臨床檢驗中心，上海200126)

采用冷凍干燥工藝制備地區性凝血因子室間調查品的初步研究

宋穎1，戴菁1，王青2，丁秋蘭1，王學鋒1

(1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海200025;2.上海市臨床檢驗中心，上海200126)

目的采用冷凍干燥工藝制備血漿凝血因子室間調查品。方法對新鮮血漿進行處理加入凍干保護劑，分裝后冷凍干燥，使其符合《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》(CNAS－GL03)的要求。將自制的凝血因子調查品分別發至醫院進行凝血因子測定。結果采用篩選試驗和正交實驗，得到的凍干保護劑的最佳配方為海藻糖(1.5%)、甘氨酸(0.5%)、4－羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，0.2%);分裝精度為每瓶的平均分裝值為0.569 9 g，范圍從0.564 6 g～0.576 7 g，s為0.003 5 g且變異系數(CV)為0.61%。自制凍干品的平均含水量為1.22%，s為0.197%，CV為16%。均勻性采用兩種方法評估:(1)F檢驗:F值為0.06;(2)T檢驗:P=0.053，所以均勻性符合CNAS－GL03要求;穩定性采用|－|≤0.3σ，即差值的絕對值為0.07＜界值1.702符合GL03要求。采用自制凍干品進行室間調查，凝血因子Ⅷ結果為自制凍干品CV%分別為21.3、16.6、25.8(與衛生部臨床檢驗中心的調查結果類似)。結論自制凝血因子的室間調查品可以滿足地區性質量控制計劃的需要。

凝血因子Ⅷ;凍干品;室間調查品

國際公認的血友病患病率在1/5 000男性，據此估計我國血友病患者人數約為14萬人左右，而目前登記在冊的血友病患者不足一成，說明多數血友病患者沒有得到正確診斷[1]。血友病患者進行正確的診斷，除了臨床表現外，實驗室檢查特別是凝血因子活性的檢測是疾病診斷的重要依據。

在上海地區已有多家三級醫院開展血友病甲的凝血因子Ⅷ檢測工作，衛生部臨床檢驗中心和上海市臨床檢驗中心于2014年分別開展了凝血因子的室間質評計劃[2]。但所采用的室間調查品均為進口商品質控品，由于價格昂貴、濃度水平單一，無法滿足室間質評的需要。我們采用冷凍干燥技術處理新鮮血漿，制備凝血因子室間調查品，并在上海地區開展凝血因子室間調查活動。

材料和方法

一、材料和儀器

所用試劑和儀器分別見表1和表2。

二、方法

1.血漿選擇和處理獻漿員經測試乙肝表面抗原、丙肝抗體和人類免疫缺陷病毒－1(HIV－1)抗體檢測均陰性。制備的室間調查品凝血因子Ⅷ包括低、中和高3個濃度水平。凝血因子血漿的制備方法:抗凝劑為枸櫞酸鹽、磷酸鹽、葡萄糖和腺嘌呤(CPD－A)，抗凝劑與血漿比例為36 mL∶200 mL，血液以1 200×g離心15 min，分離上層液體至三聯袋中得到血漿，在22℃條件下以2 300×g離心10 min(每單位血漿加入凍干保護劑，然后以相同條件離心后待用，經檢測凝血因子濃度約為40%～100%，可作為高濃度凝血因子血漿[3]。(1)低濃度凝血因子血漿的制備方法:血漿中加入硫酸鋇(BaSO4)與血漿比率為1∶7(w/v)(BaSO4需經121℃高壓滅菌15 min)，加入后在混勻器上混勻30 min。以2 300×g離心10 min。取上清液，即為凝血因子含量低濃度的血漿;(2)中濃度凝血因子血漿的制備方法:將低濃度凝血因子血漿與未處理的原液按一定比例稀釋，可得到凝血因子Ⅷ濃度為7%～50%的各濃度血漿。配制后的血漿濃度與預期濃度比較，用回歸方程統計，并用配對t檢驗統計配制結果是否符合預期)。

2.凍干保護劑配方為提高凍干制品的穩定性，在凍干前需在血漿中加入一定配方的凍干保護劑。(1)初篩實驗:實驗采用HEPES、甘氨酸、PEG、海藻糖按不同的配比分成10個組別，添加入血漿后在相同的真空壓力下進行冷凍干燥[4]，測定PT和APTT結果，通過APTT、PT、Fbg變化情況、凍干品外觀兩個方面選擇凍干前、后樣本測定值變化最小，且凍干品外觀最佳的保護劑[5];(2)凍干保護劑配方的優化:采用正交試驗設計的方式[6]，該設計是研究多因素多水平的一種設計方法，根據正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的9點進行試驗，通過這9個點的檢測結果，并按一定的統計分析方法，以獲取最佳配比組合。

計算極差R值，R值為最好平均試驗結果與最差平均試驗結果的差值，反映此因素對于考察指標的影響程度。差值最大的因素為最主要的因素，依次類推，從而得到最佳的海藻糖、甘氨酸和HEPES組合。

3.血漿分裝由于凍干品是采用冷凍干燥技術將原有液態樣本進行冷凍干燥處理使其成為固態，使用時將凍干品中加入定量的液體，復溶成液態樣品。因此，對分裝的樣本量有精度要求。本實驗采用IBS公司的Dose－it 803分裝儀對血漿進行分裝，并在分裝的過程中抽取一定比例的樣本(每5支抽取1支)，共抽取10支，用稱重法得到分裝前、后樣本的重量，兩者重量相減即為分裝的樣本量，計算后得到分裝精度。評價方法采用樣本加入量的平均值(s)和變異系數(CV%)。分裝精度與歐洲凝血因子Ⅷ標準品分裝精度相比較[3]。

4.樣本凍干過程將在－40℃低溫冰箱中預凍過夜的樣本，快速放入Christ凍干機按既定程序完成冷凍干燥過程，具體步驟包括:啟動凍干機，預冷至－60℃放入制品，在此溫度下進行升華干燥，持續時間約為6 h;提升隔板溫度進行解析干燥，持續時間為20 h。凍干完成后加蓋放入4℃保存。

5.凝血因子凍干品性能評估對制備的室間調查品的性能進行評估，其中均勻性和穩定性應符合《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》(CNAS－GL03)要求[7]。此外，凍干品的含水量應符合《中國藥典》的要求[8]。

6.組織初步調查將制備的凍干血漿調查品發放至上海5家臨床實驗室進行凝血因子活性的實驗室間評價。

結果

一、不同濃度凝血因子Ⅷ的配制效果

采用回歸分析方法，將各濃度梯度調查品的測定值與預期值進行比較，繪制預期值與實測值的關系圖(圖1)，計算回歸方程及r2值分別為Y =0.977 5X+0.747 8，r2值為0.995 2。凝血因子Ⅷ%實測值與預期值作配對t檢驗，結果差異無統計學意義(P值為0.330，P＞0.05)。

二、凍干保護劑篩選試驗

初篩試驗和配方優化試驗，結果見表3～6。

其中，A組為2.5 mg/mL氨基酸;B組為5 mg/mL甘氨酸;C組為10 mg/mL甘氨酸;D組為5 mg/mL HEPES;E組為10 mg/mL HEPES; F組為2.5 mg/mL PEG;G組為2.5 mg/mL PEG; H組為2.5 mg/mL海藻糖;I組為2.5 mg/mL海藻糖;J組為未加保護劑。

按原定方案選擇凍干前、后差異較小，凍干外觀較佳的為B、D、E、H組成分作為凍干保護劑的主要成分。

K1為每列中所有“1”序列之和，K2為每列中所有“2”序列之和，K3為每列中所有“3”序列之和;k1=K1/3，k2=K2/3，k3=K3/3;R值為極差值，為每列中最大值與最小值的插值，R值最大為因素1，R值最小為因素3，因素1＞因素2＞因素3。據此得出，海藻糖為主要因素，對每個因素的k3最大，所以最佳配方是海藻糖(1.5%)、甘氨酸(0.5%)和HEPES(0.2%)。血漿中加入此配方的保護劑，凍干后凝血Ⅷ%的回收率能達到100%左右。

三、分裝精度的評價

結果見表7。統計得到分裝精度為每瓶的平均分裝值為0.569 9 g(扣除試管本身重量)，范圍為0.564 6～0.576 7 g，s為0.003 5 g，CV為0.61%，與歐洲凝血因子Ⅷ標準品分裝精度CV為0.61%相一致。

四、調查品評估

1.均勻性和穩定性用同質性檢驗證明樣本一致性程度，由于凝血因子Ⅷ%一期法檢測是基于APTT實驗的，所獲得的凝血因子Ⅷ%測定值為通過定標曲線折算后的結果，所以同質性檢驗以APTT秒數為基準。以凍干前、后APTT測定值(秒數)的平均數計算均勻性和穩定性結果，見表8。

2.樣本含水量應用Karl Fischer滴定分析法測定凍干樣本的含水量。按《中國藥典》規定，凝血因子Ⅷ凍干品的含水量應小于3%，我們自制凍干品平均含水量為1.22%，s為0.197%，CV為16%，符合要求。

五、實驗室室間調查

采用自制質控品水平1、水平2、水平3，結果見表9。

討論

上海地區目前多家三級醫院開展凝血因子檢測項目。上海市臨床檢驗中心對凝血項目的開展情況進行了一次調查，發現凝血項目檢測(包括凝血因子)普遍存在的問題:(1)試劑批號更換頻繁:檢測人員無法獨立完成定標操作，主要依靠廠商的技術員。每次檢測前未進行定標操作;(2)定標方法錯誤:未采用實測法獲得定標曲線;(3)實驗室未參加室間質評計劃，無法評價不同實驗室檢測結果之間的一致性。為此，開展凝血因子室間調查非常有必要。

通過我們的研究表明，凝血因子的均勻性和穩定性符合《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》的要求，室間調查結果顯示，自制凝血因子凍干品和商品化的質控品在所調查的5家醫院實驗室結果間CV%分別為:水平1(21.3%)，水平2(16.6%)，水平3(25.8%)，與衛生部臨床檢驗中心的調查結果(CV約20%)比較接近，所以自制凝血因子調查品的測定結果也部分反映實驗室的實際檢測水平。

凝血因子檢測項目的逐步開展，凝血因子檢測的規范化也隨之完善，世界血友病聯盟(WFH)也對凝血因子的實驗室檢測提出規范化要求。在上海，開展凝血因子檢測項目的實驗室遠低于國外的實驗室，凝血因子的檢測方法絕大多數實驗室仍然局限于一期法。使用高敏試劑的實驗室數量極少。每批凝血因子項目檢測進行重新定標的實驗室也很少。這種情況與國外實驗室的因子檢測水平相比存在較大差距。2002年已經頒布WS/T 220－2002《中華人民共和國衛生行業標準凝血因子活性測定總則》。

此次制備的凝血因子調查品缺乏溯源性，調查沒有采用經賦值的凍干品。對于某個室間調查項目，參加實驗室少于10家的情況下，由于所采用的檢測系統不同，無法將所有實驗室的檢測結果相加求平均值，造成所有檢測結果未達到統計學最少例數，降低了統計結果的可靠性。這種情況下可由兩種解決方法:(1)采用經賦值的凍干調查品進行室間調查，即將已賦值的調查品發放至各實驗室進行室間調查，將回饋結果與賦值結果相比較，得到反饋報告;(2)增加調查實驗室的個數，達到統計學要求。

不同國家和地區相繼建立自身的凝血因子檢測的標準品體系。中檢院雖然凝血因子Ⅷ標準品出售，但價格昂貴，缺乏臨床使用價值。臨床上使用最多的還是商品化的標準血漿，由于每個系統所用標準血漿不同，檢測結果的可比性存在一定差異。文獻表明凝血因子檢測的最主要的影響因素是標準品存在差異。此外，上海市臨床檢驗中心的主要職能就是幫助各醫院實驗室操作者掌握標準的操作規范，為此我們實驗室應該為需要的實驗室提供技術支持。并且作為世界衛生組織(WHO)試劑合作中心，我們應加強與WHO在Shefield的凝血總部合作，研制出一種可以溯源至國內甚至國際標準品的比對物質，然后將凍干品發放給各醫院的實驗室，與臨床樣本同步檢測，這樣可以提高檢測的可靠性。同時也為臨床實驗室節約成本支出。

[1]丁秋蘭，王學鋒，王鴻利，等.血友病診斷和治療的專家共識[J].臨床血液學雜志，2010，24(1):49－53.

[2]成斐，王學鋒，周文賓，等.凝血因子Ⅷ和Ⅸ實驗室檢測現狀調查與分析[J].中華檢驗醫學雜志，2014，37(3):203－206.

[3]BARROWCLIFFE TW，HUBBARD A，WELLER L，et al.The certification of a European reference plasma for factorⅧ:BCR－629[M].Luxembourg:Office for Official Publications of the European Communities，2004.

[4]BAKALTCHEVA I，O'SULLIVAN AM，HMEL P，et al.Freeze－dried whole plasma:evaluating sucrose，trehalose，sorbitol，mannitol and glycine as stabilizers[J].Thromb Res，2007，120(1):105－116.

[5]姚靜，張自強.藥物凍干制劑技術的設計及應用[M].北京:中國醫藥科技出版社:2007，232－234.

[6]陳志翔，屈榮華，李培朵，等.復方板藍根顆粒沸騰制粒干燥工藝研究[J].中國藥業，2009，18(4):42.

[7]CNAS－GL03:2006.能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南[S].

[8]王箐舟，趙卉，王威，等.第四批人凝血因子Ⅷ國家標準品制備和標定[J].中國藥品標準，2013，14(3):188－190.

Primary research on freeze drying technology for the preparation of coagulation factor external quality control material in local area

SONG Ying1，DAI Jing1，WANG Qing2，DING Qiulan1，WANG Xuefeng1.(1.Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025，China;2.Shanghai Center for Clinical Laboratory，Shanghai 200126，China)

ObjectiveTo use freeze drying technology for preparing plasma coagulation factor external quality control material，in order to use it into local quality control scheme.MethodsFresh plasma was treated with freeze drying protective agent.Filling the plasma in vials，Germany Christ freeze dryer was used to lyophilize the plasma.The self－made materials were prepared，which should meet the requirements of Guidance on Evaluating the Homogeneity and Stability of Samples Used for Proficiency Testing(CNAS－GL03).The materials were deliveried into several hospitals for the determination of coagulation factor.ResultsBy screening tests and orthogonal experiments，the optimum freeze drying protective agent's formula was trehalose(1.5%)，glycine(0.5%)and HEPES(0.2%).The average packing bottle precision value was 0.569 9 g(net weight)，ranging from 0.564 6 g to 0.576 7 g，S was 0.003 5 g，and coefficient of variation(CV)was 0.61%.The average moisture of self－made lyophilized product was 1.22%，S was 0.197%，and CV was 16%.Homogeneity testing used 2 methods to evaluate(1)F test:F=0.06;(2)T test:P= 0.053 so the homogeneity met the requirements of CNAS－GL03.The stability testing used|－|≤0.3σ，and the absolute value of difference was 0.07，which was＜critical value 1.702，which met the CNAS－GL03 requirements.By using self－made lyophilized product in external quality control survey，the results of coagulation factorⅧCV%were 21.3，16.6 and 25.8(the results were similar to those of the National Center for Clinical Laboratory).ConclusionsThe self－made coagulation factor external quality control material can meet the requirements of external quality control scheme in local area.

Coagulation factorⅧ;Lyophilized product;External quality control material

1673－8640(2015)03－0269－05

R446.1

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.017

2014－07－09)

(本文編輯:儲怡星)

宋穎，女，1977年生，學士，副主任技師，主要從事臨床血液體液檢測工作。

王學鋒;聯系電話:021－64232858。