宮頸上皮內瘤變細胞中Ki67的表達及與HPV感染相關性研究

肖 慶，黃 震，遲秀文，孫俊生，宋麗君，蒲 榮

(1.廣東省深圳市龍崗中心醫院 518116；2.廣東醫學院護理學院，廣東東莞 523808；3.廣東醫學院附屬醫院，廣東東莞；4.廣東省東莞市石龍人民醫院 523800)

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·論 著·

宮頸上皮內瘤變細胞中Ki67的表達及與HPV感染相關性研究

肖 慶1，黃 震1，遲秀文2，孫俊生1，宋麗君3，蒲 榮4△

(1.廣東省深圳市龍崗中心醫院 518116；2.廣東醫學院護理學院，廣東東莞 523808；3.廣東醫學院附屬醫院，廣東東莞；4.廣東省東莞市石龍人民醫院 523800)

目的 研究Ki67 在宮頸上皮內瘤變(CIN)細胞涂片中的表達情況及其與人乳頭瘤病毒(HPV)感染的相關性，探討Ki67作為宮頸病變篩查的一種新的有效指標的可行性。方法 采用免疫組織化學檢測Ki67在138例不同程度宮頸病變細胞涂片中的表達，同時取40例宮頸炎患者作對照，并與病理學及HPV分型檢測結果進行比較。結果 Ki67在宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ組中的陽性率分別為7.5%(3/40)、60%(30/50)、87.5%(42/48)，各組差異有統計學意義(P<0.01)。HPV在宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ組中的陽性率分別為20%(8/40)、66%(33/50)、91.7%(44/48)，各組差異有統計學意義(P<0.01)。Ki67的表達與HPV感染在CINⅠ組、CIN Ⅱ～Ⅲ組中呈正相關，相關系數在CINⅠ組、CIN Ⅱ～Ⅲ組分別為0.63、0.66(P<0.01)。結論 HPV的感染與宮頸鱗癌的發生密切相關，并與進展有關。檢測Ki-67可作為篩查宮頸病變、判斷預后的有效指標。

宮頸上皮內瘤變； Ki67； 人乳頭瘤病毒

宮頸上皮內瘤變(CIN)是一組與宮頸癌密切相關的癌前病變的統稱，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級，級別越高，發展為惡性腫瘤的概率就越大，因此CIN的早期診斷及分級對治療及預后意義重大[1]。液基制片技術(TCT)是細胞學標本采集及玻片制備過程的重大改良,但由于取材和形態學觀察等原因，在診斷中不可避免地出現誤診。人乳頭瘤病毒(HPV)DNA檢測是從病因學角度進行宮頸病變的篩查，診斷方面仍存在著特異性低等問題。因此，尋找有助于細胞學準確診斷的有效指標具有重要意義。Ki67是一種核增殖標志基因,可能與細胞周期蛋白密切相關，通常被作為腫瘤細胞的增殖標記[2]。本研究旨在探討Ki67在宮頸上皮細胞惡變表達水平及與HPV感染相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年5月至2012年5月深圳市龍崗中心醫院婦產科就診患者的138例細胞標本，年齡23～60歲。所有患者均進行了薄層液基細胞學檢測、HPV分型檢測及病理組織檢查。根據組織病理學標準診斷進行分組，同一患者中若同時存在不同級別的病變,以最高級別作為該病例的最后病理診斷,其中CINⅠ組50例,CIN Ⅱ～Ⅲ組48例，同時以40例宮頸炎作為對照組。免疫組織化學使用鼠抗人單克隆抗體Ki67及二抗、SP系統工作液、DAB染色液均購自福州邁新公司。HPV分型檢測試劑盒購自潮州凱普公司。

1.2 方法

1.2.1 收集細胞保存液中細胞，離心法制片。選擇滿意的TCT制片，95%酒精固定15 min，自來水沖洗后，進行微波法修復抗原。將切片置于檸檬酸抗原修復液中(PH=6.0)，微波爐中加熱沸騰后保溫10 min，3%的H2O2中室溫孵育10 min阻斷內源性過氧化物酶的活性，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，滴加牛血清，室溫下孵育10 min后甩去，滴加第一抗體，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS液沖洗。先后滴加二抗和D液，室溫各孵育10 min。DAB鏡下顯色，自來水終止反應，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.2 HPV分型檢測方法 用特制毛刷深入宮頸口內2～3 cm，順時針旋轉2～3周，獲足夠宮頸脫落細胞，采用核酸分子快速導流雜交基因芯片技術檢測21種HPV亞型。檢測步驟包括：(1)樣本DNA提取，采用分離法；(2)基因擴增：加入已提取DNA樣本1 μL，反應總體系25 μL，設置陰、陽性對照組后進行基因擴增：95 ℃ 9 min后進入循環95 ℃ 20 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s 共40個循環 最后72 ℃ 5 min；(3)雜交：將產物95 ℃ 5 min變性，冰浴2 min以上，使樣本分子導流穿過固定有DNA探針的低密度基因芯片薄膜后進行快速雜交。顯色后觀察結果。薄膜上質控點Biotin和IC點顯色，提示檢測過程正常。根據芯片薄膜HPV亞型分布的相應著色點判斷。

1.2.3 免疫細胞化學染色的結果判定 采取以下評判標準，Ki67以細胞核呈黃色或黃褐色顆粒為陽性,根據陽性細胞所占百分比分為:(-)為0%～<5%,(+)為5%～<25%,(++)為25%～50%,(+++)為大于50%。

1.2.4 統計學處理 應用SPSS11.0統計軟件，各組率的差異性進行χ2檢驗，各組相關性分析用kappa檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Ki67在不同宮頸病變細胞中的表達 40例宮頸炎有3例Ki67陽性，均為弱陽性，陽性率為7.5%(3/40)；50例CINⅠ患者有30例Ki67表達陽性，27例弱陽性，3例中度陽性，陽性率為60%(30/50)；CINⅡ～Ⅲ患者有42例Ki67表達陽性，10例弱陽性，20例中度陽性，12例強陽性，陽性率為87.5%(42/48)。炎癥組與CINⅠ組比較，差異有統計學意義(χ2=26.4，P<0.01)，CINⅠ與CINⅡ～Ⅲ組比較，差異有統計學意義(χ2=9.5，P<0.01)，炎癥組與CINⅡ～Ⅲ組比較，差異有統計學意義(χ2=55.9，P<0.01)。

2.2 HPV在不同宮頸病變中的陽性率 40例宮頸炎有8例HPV陽性，陽性率為20%(8/40)；50例CINⅠ患者有33例HPV陽性，陽性率為66%(33/50)；CINⅡ～Ⅲ患者有44例HPV陽性，陽性率為91.7%(44/48)，炎癥組與CINⅠ組比較，差異有統計學意義(χ2=19.0，P<0.01)；CINⅠ與CINⅡ～Ⅲ組比較，差異有統計學意義(χ2=9.6，P<0.01)；炎癥組與CIN Ⅱ～Ⅲ組比較差異有統計學意義(χ2=46.4，P<0.01)。

2.3 不同宮頸病變中Ki67陽性表達與HPV感染情況的相關性 85例HPV(+)標本中，Ki67在炎癥組、CINⅠ組、CINⅡ～Ⅲ組中的陽性數分別為1、26、40例；53例HPV(-)標本中，Ki67在炎癥組、CINⅠ組、CIN Ⅱ～Ⅲ組中的陽性數分別為2、4、2例，Ki67陽性表達與HPV感染在CINⅠ組、CIN Ⅱ～Ⅲ組呈正相關，Ki67的表達與HPV感染的Kappa相關系數炎癥組(r=0.36，P>0.01)，CINI組(r=0.63，P<0.01)，CIN Ⅱ～Ⅲ組(r=0.66，P<0.01)。

3 討 論

Ki67抗原是標志細胞增殖的重要指標，與腫瘤的發生、發展及預后關系密切，其基因定位于人第10號染色體。Ki67 是一種增殖細胞相關的核抗原，其表達范圍覆蓋了除G0期以外的各增殖周期細胞，為目前檢測腫瘤細胞增殖活性的最可靠指標之一[3]。Ki67的表達局限在增生的基底部細胞中，因此在正常宮頸刮片中幾乎查不出來，而在宮頸異常的組織活檢中，Ki67染色可見于黏膜上皮層表面發育異常的細胞核中，且與發育異常的程度成比例。本研究顯示，Ki67在非腫瘤性宮頸鱗狀上皮標本中限于基底及副基底層,在CINⅠ級中呈陽性表達可達中層,而CINⅡ～Ⅲ級中則可達全層，本文Ki67在宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ組中細胞的陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.01)。Ki67從正常宮頸組織至CIN呈逐漸增高趨勢,且隨 CIN 級別增高,推測Ki67的表達與CIN進展有關。因此，本文提示Ki67可能是宮頸上皮細胞惡性轉變過程中出現的生物標志物,能較可靠地反映正常和病變細胞的增殖活性，可作為CIN級別評判的一個有效指標，有可能成為預測預后的指標。這與Sari等[4]報道基本一致。因此Ki67可作為術前內分泌治療及評價乳腺癌術后治療和預后的可靠預測指標之一[5]。

HPV與CIN和宮頸癌有密切關系,HPV感染應視為與 CIN 相關的早期病變[6]。本文HPV在宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ組中的陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.01)。從CIN到浸潤性宮頸癌的演變過程中，高危HPV感染是宮頸癌的主要致癌因子之一。當宮頸上皮感染HPV后細胞增殖活性升高，抑制及破壞人體局部的免疫功能，從而促進細胞過度增殖最終癌變[7]。Ki67的表達與HPV感染在CINⅠ組、CINⅡ～Ⅲ組中呈正相關，相關系數在CINⅠ組、CIN Ⅱ～Ⅲ組分別為0.63、0.66(P<0.01)。HPV感染后改變了細胞周期調節基因的表達，促使細胞異常增殖，使Ki67呈現過度表達，可見在宮頸病變的發生、發展連續過程中伴有細胞增殖能力的明顯增強[8]。

綜上所述，推測Ki67在HPV二者表達上調可能與宮頸癌的發生、發展、浸潤、轉移過程相關，聯合檢測Ki67和HPV可作為判斷宮頸癌生物學行為及預后的重要指標，有利于運用Ki67和HPV共同監測宮頸疾病進展情況，協助診斷CIN，為及時治療癌前病變提供廣闊的發展前景。

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[4]Sari AF，Safaei A，Pourjabali M，et al．Evaluation of Ki67，p16 and CK17 markers in differentiating cervical intraepithelial neoplasia and benign lesions[J].Iran J Med Sci，2013，38(1)：15-21．

[5]Koc N，Sahin D，Ayas S．Reevaluation of negative cone biopsy results after a positive cervical biopsy finding[J]．J Low Genit Tract Dis，2013,17(2)：154-159．

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Study on correlation between Ki67 expression in cervical intraepithelial neoplasia cells with HPV infection*

XIAOQing1,HUANGZhen1,CHIXiu-wen2,SUNJun-sheng1,SongLi-jun3,PURong4△

(1.LongangCentralHospital,Shenzhen,Guangdong518116,China;2.NursingInstituteofGuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China;3.AffliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China;4.ShilongPeople′sHospital,Dongguan,Guangdong523800,China)

Objective To study the expression level of Ki67 in cell smear of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and its relationship with human papilloma virus (HPV) infection,and to investigate the feasibility of Ki67 as a new effective indicator in screening of cervical lesion.Methods The expression of Ki67 was detected by immunocytochemical method in 138 cases of different grade cervical lesions,at the same time,40 cases of cervicitis were chosen as control and the detection results were compared with the pathology and HPV typing detection results.Results The positive rate of Ki-67 in cell smear of cervicitis,CINⅠ and CINⅡ-Ⅲ groups were 7.5%(3/40),60%(30/50),87.5%(42/48) respectively,the differences were statistically significant(P<0.01).The positive rate of HPV in cervicitis,CINⅠ and CIN Ⅱ-Ⅲ groups were 20%(8/40),66%(33/50) and 91.7%(44/48) respectively,the differences were statistically significant(P<0.01).The expression of Ki67 in CINⅠ and CIN Ⅱ-Ⅲ groups was positively correlaed with HPV infection.The correlation coefficients were 0.63 and 0.66 respectively(P<0.01).Conclusion HPV infection is closely related with the cervical squamous cell carcinoma occurrence and its progress.The detection of Ki67 could be taken as an effective indicator for screening of cervical lesion and judging prognosis.

cervical intraepithelial neoplasia; Ki67; human papilloma virus

廣東省深圳市科技計劃項目(201203315)。

肖慶，男，本科，主管檢驗師，主要從事臨床檢驗研究。

△通訊作者，E-mail:ljj8433@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.015

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1672-9455(2015)14-2014-02

2015-02-20

2015-03-18)