分子成像技術在小分子酪氨酸激酶抑制劑開發中的應用

程雁，孫夕林，申寶忠

分子影像技術是指運用影像學方法研究活體狀態下組織、細胞和亞細胞等的特定分子水平變化。其中，分子或細胞水平反映的是生物體生理、病理變化，它為在體監測疾病過程、在體示蹤基因治療、在體評價藥物療效及在體揭示分子活動規律提供了嶄新的技術方向。并將遺傳基因信息、生物化學與新的成像探針進行綜合，利用精密的成像技術來檢測，通過一系列的圖像后處理技術，真正達到在體、實時、動態、無創、特異等優點[1，2]。以往的小分子酪氨酸激酶抑制劑的臨床前治療藥物療效評價都是在離體細胞水平以及動物實驗基礎上開展的。動物實驗研究通過觀察移植瘤經藥物治療前后的體積，并根據治療前后體積縮小的程度來評價不同藥物治療的效果，從而篩選出臨床候選藥物及藥物的最佳使用劑量。現如今，利用分子成像新技術可獲取許多新的在體數據，如腫瘤生長動力學評估；腫瘤功能及分子成像；促血管生長因子；腫瘤細胞標記物等活體分子成像，并可在無創的條件下研究肺癌發病機制。此外分子影像技術還有可能通過對活體實時分子靶目標評估來篩選治療藥物[1，3]。如果將分子成像與微創治療相結合，使我們有可能在發現疾病的同時實現在體直接治療。

分子影像技術與傳統影像技術

分子影像技術主要利用核醫學（positron emission tomography，PET）、磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）和光學（optical coherence tomography，OCT）等醫學影像技術，在分子水平上對人體內部生理或病理過程進行無創、實時成像。傳統的醫學影像技術以人體內部的物理性質或生理特性作為成像對比源，這些物理量和生理量沒有特異性。經典的影像診斷（X線、CT、MRI、超聲等）主要顯示的是一些分子的改變，即器官發生了器質性變化之后才能檢查到，僅能用于具有解剖學改變的疾病檢測。而分子影像技術不僅能夠探查疾病過程中細胞和分子水平的異常，還能在疾病尚無解剖改變前檢出異常，為探索疾病的發生、發展和轉歸，評價藥物的療效以及在生物學和臨床醫學發展之間起到橋梁作用[1，4，5]。

酪氨酸激酶及其小分子抑制劑

近年來，腫瘤病理學、細胞生物學、腫瘤基因學等研究取得了巨大的進展，其中惡性腫瘤細胞內的信號轉導、細胞周期的調控、細胞凋亡的誘導、血管生成以及細胞外基質的相互作用等各種過程正在被逐步闡明。將這些信號轉導通路的關鍵酶作為藥物篩選靶點，發現選擇性作用于特定靶點的高效、低毒、特異性強的新型抗腫瘤藥物已成為當今抗腫瘤藥物研究發展的重要方向。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質，它能催化ATP分子上γ-磷酸基轉移到許多重要底物蛋白質的酪氨酸殘基上，使其發生磷酸化。這一過程是酪氨酸激酶抑制劑研發的重要切入點，研究者們也是依據ATP競爭性抑制的原理建立了眾多酪氨酸激酶抑制劑分子水平的影像篩選方法[3，6，7]。已有資料表明，超過50%的原癌基因和癌基因產物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，他們的異常表達將導致細胞增殖調節發生紊亂，進而導致腫瘤發生[6，8]。事實上，以酪氨酸激酶為靶點進行抗腫瘤藥物的開發已成為國際研究的前沿[8，9]。

分子成像技術在小分子酪氨酸激酶抑制劑開發中的應用

分子影像技術可對基于小分子靶向性的酪氨酸激酶抑制劑進行篩選，臨床候選藥物的藥代動力學和藥效學特性分析，藥物分子所作用的靶點以及生物過程的體內效果可視化有所幫助[10]。這種方法可用于篩選小分子酪氨酸激酶抑制劑臨床候選藥物和測定藥物代謝時間及最佳使用劑量。因此，分子影像技術具有加快臨床前期和臨床期作用于腫瘤的酪氨酸激酶抑制劑類藥物開發的潛力[11，12]。

1.同位素法

同位素法是一類較早應用于酪氨酸激酶抑制劑篩選的經典方法。惡性腫瘤細胞的主要代謝特點是高葡萄糖代謝，因此我們可以用18F-脫氧葡萄糖（18F-2-fluoro-D-deoxy-glucose，18FFDG）作為篩選腫瘤治療藥物的代謝示蹤劑。NAII等[12]用PET／CT對經吉非替尼治療的非小細胞肺癌患者進行成像獲取18F-FDG-葡萄糖的攝取情況，觀察吉非替尼對肺癌患者的治療療效，并根據患者的原發腫瘤的最大標準攝取值（SUV）的大小，利用患者的反應率和存活率間接評價藥物的活性。也有研究報道對首次經甲磺酸伊馬替尼治療胃腸道間質腫瘤病人使用18F-FDG-PET檢測24h內藥物療效改變，研究結果表明經小分子酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼治療后也表現出較好的治療效果[13，14]。最近有研究證實非小細胞肺癌小鼠模型給予吉非替尼治療的48h內，18F-FDG的攝取敏感型降低，并于48h后評價腫瘤對吉非替尼的反應，這有益于我們篩選出吉非替尼治療敏感的患者以及吉非替尼使用的局限性[15，16]。此外，FDGPET影像技術在評價藥物藥效中的作用要遠遠優于以往通過收集患者存活時間數據來評價藥物療效[17]。

還有一部分示蹤劑技術是用來探測小分子酪氨酸激酶抑制劑對機體腫瘤的乏氧顯像。18F標記的氟化硝基咪唑阿拉伯糖苷（18F-fluoroazomycin-arabinoside，FAZA）是 腫 瘤 乏 氧 顯 像的常見示蹤劑，該示蹤劑在缺氧環境中可形成活躍的自由基并與細胞大分子共價結合。結合FAZA的PET成像技術顯示：EGFR受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼（易瑞沙，阿斯利康公司）降低了大鼠鱗狀細胞癌轉移中的組織缺氧[18]，間接地證實了吉非替尼對腫瘤的治療療效。腫瘤的乏氧顯像在酪氨酸激酶抑制藥物開發中具有重要的價值。

近年來，隨著分子靶向治療的深入，以TK為前體標記核素的腫瘤表皮生長因子受體（EGFR）分子影像酶顯像也逐漸受到關注。因為酶不僅能催化體內生物化學過程還具有極高效率、高度特異性及反應的可調節性等優點。Johnstrom等[19，20]合成11C-4-（3-溴苯氨基）-6，7-雙甲基喹唑啉（PD153035），并應用PET顯像評價其在裸鼠體內的分布，隨著EGFR表達水平的升高攝取量增加。研究結果顯示11C-PD153035的放射性攝取與EGFR表達水平顯著相關，T／NT比值在40～50min內達高峰，不同的腫瘤峰值不同，T／NT比值與EGFR的表達水平成明顯正相關。間接說明腫瘤組織對小分子酪氨酸激酶抑制劑PD153035有較高的敏感性。

2.膽堿酯酶標記法

膽堿標記物通常反應腫瘤細胞的增殖情況，14C-甲基標記的膽堿可用于針對酪氨酸激酶受體（TKR-Ras-Rafl-MEKERK）級聯反應，這為分子成像技術在信號轉導通路中可視化應用提供了可能，也為檢測小分子酪氨酸激酶抑制劑在體內的作用提供了可能性[21]。目前胸腺嘧啶核苷（18F-FLT）在檢測核酸的合成和代謝情況中的特異性高于臨床常用的腫瘤PET藥物18F-FDG，為酪氨酸激酶抑制劑抑制腫瘤細胞增殖的檢測及監控此類藥物代謝情況提供了有效的方法[22，23]。

Hsin等[24]發現與之前報道的小分子酪氨酸激酶顯像劑[124I]-IPQA相比，[18F]F-PEG6-IPQA具有更好的藥代動力學特點。這一特點說明PEG6具有提高EGFR高表達的放射性標記化合物示蹤技術在腫瘤分子成像應用中的潛能。[18F]FPEG6-IPQA的PET／CT成像技術可被用來檢測表達EGFR L858R突變的腫瘤以及與[18F]F-PEG6-IPQA藥代動力學相似的小分子酪氨酸激酶抑制劑治療優勢人群的篩選。本研究還可以通過對比治療前后[18F]F-PEG6-IPQA的攝取情況評價小分子酪氨酸激酶抑制劑的療效。

3.多模態分子成像

多模態分子影像技術在腫瘤早期診斷中的應用主要以熒光分子探針為基礎，合成多功能靶向探針，結合光學成像與MRI來實現腫瘤及癌前病變的早期診斷[25，26]。宋歌[27]構建了QDs＠Gd3±RGD[一類含有精氨酸.甘氨酸-天冬氨酸（Arg.Gly.Asp）的短肽]雙模態顯像納米探針成功實現體外大腸癌Lovo細胞的MRI顯像及治療作用。張琨[28]采用化學交聯法構建VEGF抗體MR靶向超順磁性分子探針，研究表明攜帶納米鐵顆粒的抗VEGF分子探針已將腫瘤血管生成的評價發展到受體水平，為腫瘤血管生成的診斷與抗血管生成的治療提供了新的思路。Blankenberg[29]等用99mTc標記血管內皮生長因子（vascular endothrlia growth factor，VEGF）的 一 條 單 鏈（scVEGF／99mTc）可用來評估VEGF受體（VEGFR）對腫瘤治療藥物帕唑替尼抗血管生成療效。

多模態分子成像研究是對腫瘤關鍵分子靶點表皮生長因子受體（EGFR），采用光學、PET等不同成像方法，進行多模態分子成像，實現不同影像設備的優勢互補，獲得多元化信息，使監測結果更為精確[30，31]。腫瘤微環境分子成像研究。在肺癌腫瘤微環境方面，項目組利用18F-FDG（糖代謝成 像）、18F-FLT（增殖成像）和18F-FMISO（乏氧成像）三種分子成像探針，檢測其在肺癌腫瘤細胞內的攝取機制和分布，探討肺癌組織內18FFDG、18F-FLT和18F-FMISO三種分子探針攝取和腫瘤乏氧、增殖和血流灌注微環境的關系[32]。

4.評價小分子酪氨酸激酶抑制劑動力學模式

經分子影像技術篩選得到的有活性的酪氨酸激酶抑制劑，它與激酶之間的作用模式非常復雜。因此，我們需要進一步的對其激酶的動力學作用模式進行評價。根據抑制劑與激酶之間的作用特點不同，我們通常將抑制劑作用分為可逆性抑制劑和不可逆性抑制劑兩大類，而可逆性抑制劑又大致可分為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合型抑制等。目前已知的酪氨酸激酶抑制劑大多數是可逆的ATP競爭性抑制劑，近幾年來研究者們用分子影像技術發現不可逆性抑制劑和底物競爭性抑制劑具有較好的療效、較高的選擇性和較低的毒副作用[33]。

可逆性抑制與不可逆性抑制：Rabindran等[34]用同位素[14C]標記的HKI-272，證明無論從分子水平還是細胞水平來說化合物HKI-272均是酪氨酸激酶HER-2的非可逆性抑制劑。

ATP競爭性抑制：Gumireddy等[35]用同位素法研究了化合物ON012380對BCR-ABL的ATP競爭性抑制。用[γ-32P]標記ATP，由此來證明化合物ON012380是酪氨酸激酶BCRABL的非ATP競爭性抑制劑。

底物競爭性抑制：Galia Blum等[36]用同位素法研究了化合物AG538對酪氨酸激酶IGF-IR的底物競爭性抑制作用，證實了AG538是IGF-IR的底物競爭性抑制劑。

展望

隨著科學技術的發展，21世紀醫學已經逐步進入分子醫學時代，認識疾病必須從孤立的器官和系統深入到生理和生化的細胞分子水平，揭示疾病細胞分子水平上的細微變化信息，闡明病變組織代謝活性的高低來幫助疾病的診斷、治療以及藥效評價。腫瘤組織血供豐富，代謝能力增強，耗能也增加，分子影像技術檢查常用分子探針了解腫瘤在糖、脂肪和蛋白質方面的代謝活躍程度，從而對良、惡性腫瘤進行鑒別診斷。這種檢查技術對腫瘤的分級、療效觀察以及放射治療和化療所致壞死與腫瘤復發的鑒別診斷都有較高的臨床價值。分子影像技術在小分子酪氨酸激酶抑制劑開發中的巨大臨床價值和發展潛力已得到廣泛的認可并在開發新型的靶向酪氨酸激酶抑制劑中展現出巨大的應用前景。

[1]Robert E Campbell，Christopher J Chang.Molecular imaging[J].Current Opinion in Chemical Biology，2010，14（1）：1-2.

[2]Tore Skotland.Molecular imaging：challenges of bringing imaging of intracellular targets into common clinical use[J].Contrast Media Mol.Imaging，2012，7（1）：1-6.

[3]Jinhui Li，Haitong Wan，Hong Zhang，et al.Current applications of molecular imaging and luminescence-based techniques in traditional Chinese medicine[J].2011Elsevier Ireland Ltd，2011，137（1）：16-26.

[4]Kai Chen，Xiaoyuan Chen.Design and development of molecular imaging probes[J].Curr Top Med Chem，2010，10（12）：1227-1236.

[5]Fei-Fei Teng，Xue Meng，Xin-Dong Sun，et al.New strategy for monitoring targeted therapy：molecular imaging[J].International J Nanomedicine，2013，8（1）：3703-3713.

[6]Maemondo M，Inous A，Kobayashi K，et al.Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR[J].N Engl J Med，2010，363（25）：2380-2388.

[7]Willmann JK，van Bruggen N，Dinkelborg LM.Molecular imaging in drug development[J].Nat Rev Drug Discov，2008，7（7）：591-607.

[8]Gang Chen，Peer Kronenberger，Erik Teugels，et al.Targeting the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer cells：the effect of combining RNA interference with tyrosine kinase inhibitors or cetuximab[J].BMC Medicine，2012，10（1）：28.

[9]Mangala Srinivas，Ignacio Melero，Eckhart Kaempgen，et al.Cell tracking using multimodal imaging.Contrast Media Mol[J].Imaging，2013，8（6）：432-438.

[10]El-Deity WS，Sigman CC，Kellof GJ.Imaging and oncologlc drug development[J].JClin Oncol，2006，24（20）：3261-3273.

[11]Condeelis J，Weissleder R.In vivo imaging in cancer[J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2010，12：a003848.

[12]Terreno E，Castelli DD，Viale A，et al.Challenges for molecular magnetic resonance imaging[J].Chem Rev，2010，110（5）：3019-3042.

[13]NA II，Byun BH，Kang HJ，et al.18F-Fluoro-2-deoxy-glucose uptake predicts clinical outcome in patients with gefitinib-treated non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2008，14（7）：2036-2041.

[14]Van den Abbeele AD，Badawi RD.Use of position emission tomography in oncology and its potential role to assess response to imatinib mesylate therapy in gastrointestinal stromal tumors（GISTs）[J].Eur J Cancer，2002，38（5）：60-65.

[15]Ryo Takahashi，Haruhiko Hirata，Isao Tachibana，et al.Early[18F]Fluorodeoxyglucose positron emission tomography at two days of gefitinib treatment predicts clinical outcome in patients with adenocarcinoma of the lung[J].Clin Cancer Res，2012，18（1）：220-228.

[16]Maemondo M，Inoue A，Kobayashi K，et al.Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR[J].N Engl J Med，2010，362（25）：2380-2388.

[17]Stroobants S，Goeminne J，Seegers M，et al.18F-FDG-positron emission tomography for the early predicition of response in advanced soft tissue sarcoma treated with imatinib mesylate（Glivee）[J].Eur J Cancer，2003，39（14）：2012-2020.

[18]Eschmann SM，Friedel G，Paulsen F，et al.18F-FDG PET for assessment of therapy response and preoperative re-evaluation after neoadjuvant radio-chemotherapy in stageⅢnon-small cell lung cancer[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging，2007，34（4）：463-471.

[19]Johnstrom P，Fredriksson A，Thorell Jo，et al.Synthesis of[methoxy11C]-PD153035，a selective EGF receptor tyrosine kinase inhibitor[J].J Labelled Comp Radiopharm，1998，41（7）：623-629.

[20]Fredriksson A，Johnstrom P，Thorell JO，et al.In vivo evaluation of the biodistribution of11C-labeled PD153035in rats without and with neuroblastoma implants[J].Life Sci，1999，65（2）：165-174.

[21]Solomon B，Binns D，Roselt P，et al.Modulation of intratumoral hypoxia by the epidermal growth factor receptor inhibitor Gefitinib detected using small animal PET imaging[J].Mol Cancer Ther，2005，4（9）：1417-1422.

[22]McKinley ET，Ayers GD，Smith RA，et al.Limits of[18F]-FLT PET as a biomarker of proliferaction in oncology[J].PLoS One，2013，8（3）：e58938.

[23]Been LB，Suurmeijer AJ，Cobben DC，et al.[18F]-FLT-PET in oncology：current status and opportunities[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging，2004，31（12）：1659-1672.

[24]Hsin Hsien Yeh，Kazuma Ogawa，Julius Balatoni，et al.Molecular imaging of active mutant L858RRGF receptor（EGFR）kinaseexpressing nonsmall cell lung carcinomas using PET／CT[J].PNAS，2011，108（4）：1603-1608.

[25]周暉，吳俊嬌，范潔琳.多模態分子影像技術應用于腫瘤的研究進展[J].中國醫學影像學雜志，2011，19（10）：794-797.

[26]張兵波，宮曉群，李卓權.用于疾病診斷的GdⅢ／量子點多模態成像探針的構建[J].高等學校化學學報，2010，31（5）：982-985.

[27]宋歌.靶向RGD-Gd熒光納米探針在體外大腸癌細胞的MRI顯像研究[C].蘇州大學，2011.

[28]張琨.抗血管內皮生長因子MR靶向超順磁性分子探針的構建及體外大腸癌細胞顯像的實驗研究[J].中華放射學雜志，2010，44（1）：84-91.

[29]Blankenberg FC，Levashova Z，Sarkar SK，et al.Noninvasive assessment of tumor VEGF receptor in response to treatment with pazopanib：a molecular imaging study[J].Transl Oncol，2010，3（1）：56-64.

[30]Robertson R，Germanos MS，Manfredi MG，et al.Multimodal imaging with18F-FDG PET and cerenkov luminescence imaging after MLN4924treatment in a human lymphoma xenograft model[J].J Nucl Med，2011，52（11）：1764-1769.

[31]Thorek DL，Ulmert D，Diop NF，et al.Non-invasive mapping of deep-tissue lymph nodes in live animals using a multimodal PET／MRI nanoparticle[J].Nat Commun，2014，5：3097.

[32]Lee DE，Koo H，Sun IC，et al.Multifunctional nanoparticles for multimodal imaging and theragnosis[J].Chem Soc Rev，2012，41（7）：2656-2672.

[33]Tao X，Jiang H，Yu X，et al.An ultrasensitive chemiluminescence immunoassay of chloramphenicol based on gold nanoparticles and magnetic beads[J].Drug Test Anal，2013，5（5）：346-352.

[34]Sridhar K Rabindran，Carolyn M Discafani，et al.Antitumor activity of HKI-272，an orally active，irreversible inhibitor of the HER-2tyrosine kinase[J].Cancer Research，2004，64（11）：3958-3965.

[35]Kiranmai Gumireddy，Stacey J.Baker，et al.A non-ATP-competitive inhibitor of BCR-ABL overrides imatinib resistance[J].PNAS，2005，102（6）：1993-1997.

[36]Galia Blum，Aviv Gazit，et al.Substrate competitive inhibitors of IGF-1receptor kinase[J].Biochemistry，2000，39（51）：15705-15712.