基于米根霉代謝輪廓研究的能荷物質分析方法的建立

史純珍，張紅漫，李 霜，黃 和

（1.北京工商大學 食品學院，環境科學與工程系，北京100048；2.南京工業大學 生命與制藥工程學院，江蘇 南京210000）

1 引言

富馬酸又名反丁烯二酸、延胡索酸，是一種重要化工原料，被廣泛用于食品、化工、醫藥等領域。作為一種四碳平臺化合物，可進一步合成多種高價值衍生物。米根霉是發酵產富馬酸的高產菌株，本文利用HPLCUV建立了米根霉胞內6種能荷物質的檢測方法，為研究米根霉產富馬酸胞內代謝途徑提供方法平臺。

ATP、NADH、NAD為微生物代謝過程中時刻處于變化的物質，同時也是對生理活性影響較大的代謝產物，能荷物質的含量水平是微生物生理代謝中的重要考察依據[1～3]。因此是驗證提取方法的高效性及穩定性的最佳內標物[4～6]。通過考察樣品制備過程中胞內不穩定化合物的回收率，可以作為判斷樣品制備方法優劣的可靠標準。對三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和環磷酸腺苷（cAMP）這6種能荷物質建立檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

HPLC 戴安系列（P680HPLC Pump System，Chromeleon工作站，紫外檢測器 （UV））（美國戴安公司）；Eppendorf 5804R臺式冷凍離心機（Eppendorf公司）；循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；KH2200DB型數控超聲波清洗器（中國昆山禾創超聲儀器有限公司）；PHS－3C型精密pH值計（中國上海雷磁儀器廠）；RE－52A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Centrifuge 580R 低溫離心機（Eppendorf）；MDF－U32V超低溫冰箱－80℃（SANYO）。

2.2 色譜分離條件

色譜柱：Sepax HP－C18column（4.6×250mm）反相色譜柱。流動相：以A0.6%磷酸水溶液（三乙胺調pH值到6.6）；B甲醇，作為流動相，梯度洗脫；室溫25℃，流速1.0mL／min，紫外檢測器（檢測波長254nm）。

2.3 方法學考察

2.3.1 標品混合溶液的配置

分別準確稱取一定量的色譜純ATP、ADP、AMP、NAD、NADH和cAMP，用超純水配置成濃度均為1g／L的標準混合溶液，逐級稀釋為0.5g／L、0.1g／L、0.05g／L、0.01g／L、5mg／L、1mg／L、0.5mg／L、0.1mg／L、0.05mg／L的濃度。

2.3.2 精密度實驗

日內精密度：從同一個搖瓶中取2個平行樣品，經過處理后，將2個樣品溶液分別檢測6次。日間精密度：從同一個搖瓶中取2個平行樣品，經過處理后，將2個樣品分別連續3d每一天進樣一次。樣品溶液不用時需保存在－20℃下。

2.3.3 回收率實驗

準確配置50mg／L、5mg／L、0.5mg／L三個濃度的混合標準溶液，分別加入樣品溶液中，測定5種物質的回收率。

3 結果與討論

3.1 初始分離條件的選擇

ATP、ADP、AMP、NAD、NADH 和cAMP屬于低聚核苷酸，為離子樣品，檢測低聚核苷酸最常用最簡便的方法是使用高效液相色譜法[7]。本文使用反相高效液相色譜法，由于低聚核苷酸在反相色譜柱上的保留較小，因此需要加入離子對試劑使其保留增強，測定低聚核苷酸常用的離子對試劑是三乙胺[8]，質子化的三乙胺作為有效的離子對試劑能夠將電離的低聚核苷酸很牢固的結合在填料柱上。加入離子對試劑后，離子樣品的分離選擇性發生了很大變化，最大保留出現在高pH值區（樣品完全解離），又由于色譜柱的固定相長時間在堿性環境中不穩定，因此，pH選擇在中性條件下。流動相中的有機相常用的為甲醇和乙腈，甲醇毒性較小，因此選用甲醇作為有機相。

3.2 流動相中H3PO4摩爾濃度的條件優化

在初始的分離條件下，流動相的水相分別配置含有H3PO4濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的溶液，然后加入三乙胺使pH值達到6.6。隨著流動相中H3PO4濃度的增加，6種物質在色譜柱上的保留增強，保留時間延長，且在H3PO4濃度為0.6%的時候，6種物質之間的分離度最大，且達到基線分離（R＞1.5），因此選擇H3PO4濃度為0.6%。出峰順序分別為NAD，AMP，ADP，ATP，cAMP，NADH。

圖1為在此優化條件下，對6種標準物質進行分離的液相色譜圖。由圖1A可以看出6種物質在30min內全部實現基線分離。圖1B為實際樣品的分離圖譜，除AMP與ADP以外，其余4種物質也都實現了基線分離，并且AMP與ADP的峰形不影響峰面積的積分。因此，用離子對色譜法檢測分離6種物質的最佳檢測條件是：Sepax HP－C18column（4.6×250mm）反向色譜柱，A0.6%磷酸水溶液（三乙胺調pH 值到6.6）；B甲醇作為流動相，10%B保持洗脫10min，然后以3%B／min速度增至25%，室溫，流速1.0mL／min，紫外檢測器（波長254nm）。

圖1 6種能荷物質混合物的分離圖譜

3.3 外標工作曲線的線性

在標品與樣品進樣量相同的情況下，用外標法定量。準確吸取不同濃度的ATP，ADP，AMP，NADH，NAD，cAMP混合標準溶液20μL分別進樣，測定其峰面積，以峰面積A對濃度C（g／L）作圖得到標準曲線，得到6種物質的線性回歸方程、相關系數以及檢測限和定量限見表1。

從表1中可以看出，6種物質在該檢測條件下可以得到較好的線性，相關系數在0.9978～0.9995之間。檢測限（S／N﹥3）低于0.2166mg／L，檢測靈敏度較高，可用于快速檢測。

表1 標準曲線的線性參數

3.4 方法的回收率和重復性試驗

用實際樣品（胞內提取液）進行檢測，根據上述方法對檢測方法的精密度和準確度進行的實驗。實驗結果見表2。

表2 重復性試驗結果

由表2可知，6種物質的精確度都滿足實驗要求。NADH的日內精密度較小，為10.36%，這可能是由于其本身不穩定，易分解，還有一個原因，是因為NADH相較于其他五種物質而言，本身的響應值較小（峰面積較小），因此精密度較小，但是該精密度也可以滿足實驗要求。

表3 回收率測定結果

由表3中回收率的實驗結果可知，回收率在77.2%～105.2%，因此該檢測方法的準確度較高。

3.5 米根霉發酵液樣品中各物質的定量分析結果

取米根霉發酵第72h的發酵液，取3個平行樣，在上述分離條件下進行色譜分析，結果見表4。

從實驗結果中看，該方法能夠準確的測定米根霉胞內提取液中各物質的含量。

4 結語

（1）采用離子對液相色譜的方法，可以準確檢測米根霉胞內提取液中 ATP，ADP，AMP，NADH，NAD，cAMP的含量。該方法的最優檢測條件是：Sepax HP－C18column（4.6×250mm）反相色譜柱，以 A0.6%磷酸水溶液（三乙胺調pH到6.6）；B甲醇，作為流動相，梯度洗脫；室溫（25℃），流速1.0mL／min，紫外檢測器（檢測波長254nm）。

表4 不同批次間的樣品檢測結果

（2）本方法具有干擾小、靈敏度高、分析速度快等優點，該方法的建立，為研究后續的淬火和提取方法提供了可靠的依據，對代謝組學的整體研究具有重要意義。

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