促血小板生成素對化學性缺氧誘導的PC12細胞凋亡的影響*

王曉東， 陳美苑， 曾 志， 周卓妍△， 楊 默

(暨南大學 1附屬第一醫院神經外科， 2醫學院生理學系，廣東 廣州 510632； 3廣東藥學院生理學系，廣東 廣州 510006； 4南方醫科大學南方醫院血液科，廣東 廣州 510515)

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促血小板生成素對化學性缺氧誘導的PC12細胞凋亡的影響*

王曉東1， 陳美苑2， 曾 志3， 周卓妍2△， 楊 默4

(暨南大學1附屬第一醫院神經外科，2醫學院生理學系，廣東 廣州 510632；3廣東藥學院生理學系，廣東 廣州 510006；4南方醫科大學南方醫院血液科，廣東 廣州 510515)

目的： 研究促血小板生成素(TPO)對化學性缺氧誘導的大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞凋亡的影響及保護作用。方法: 將PC12細胞進行相應實驗處理，分為對照組、氯化鈷(CoCl2)處理組、CoCl2+TPO組及TPO對照組。檢測各組PC12細胞的存活率并用Annexin V/PI雙染流式細胞術分別檢測細胞凋亡率，線粒體膜電位的變化及細胞內活性氧簇的變化。結果: 化學性缺氧模擬劑CoCl2可以明顯抑制PC12細胞的生長(P<0.01)；與對照組比較，CoCl2組的細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，而CoCl2+TPO組的細胞凋亡率顯著低于CoCl2組(P<0.05)；TPO能減少細胞內活性氧簇生成以及抑制細胞線粒體膜電位的降低(P<0.01)。結論: TPO能對抗CoCl2缺氧所致的細胞凋亡，穩定線粒體膜電位，發揮細胞保護作用。

促血小板生成素； 氯化鈷； PC12細胞； 細胞缺氧； 細胞凋亡

缺血缺氧性腦損傷 (hypoxic-ischemic brain da-mage, HIBD)是臨床常見的多種疾病的共同表現。嚴重的缺血缺氧可致神經元壞死，較輕的缺血缺氧則可通過凋亡途徑造成神經元遲發性死亡，此反應在致病因素清除后仍可持續數天甚至數周。缺血缺氧導致的神經元遲發性死亡的病理生理機制很復雜，包括神經細胞能量代謝障礙、細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成增加、線粒體能量供應受阻、線粒體的損傷和細胞內鈣超載等，進而導致神經元遲發性死亡。

促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是體內重要的造血生長因子。以往的研究一直認為TPO的功能僅限于在造血系統，近年的深入研究發現其在造血系統以外也有作用。Yang等[1]首次證實中樞神經系統存在有TPO受體c-Mpl的表達。還發現TPO有促進小鼠神經干細胞株C17.2增殖和抗凋亡的作用[2]。本課題的前期研究中發現在新生大鼠缺血缺氧腦損傷模型中，早期使用TPO干預可對缺血缺氧性腦損傷造成的新生大鼠腦功能障礙起到改善作用，但機制不明[3]。本研究采用化學性缺氧模擬劑氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)誘導PC12細胞缺氧，觀察TPO對PC12細胞凋亡和線粒體膜電位的影響，為進一步探討TPO在缺氧損傷的神經細胞中的保護作用提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 細胞和主要試劑

大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株PC12由廣州醫科大學生理學教研室惠贈。PC12細胞培養于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基，在37 ℃、飽和濕度、5% CO2細胞培養箱內培養。用0.25%胰酶每2～3 d傳代1次，第3代開始用于實驗。

RPMI-1640液體培養基購自Gibco；胎牛血清購自杭州天杭生物科技公司；TPO由沈陽三生生物制藥有限公司惠贈；CoCl2、胰蛋白酶、EDTA、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)和MTT均購自Sigma；青霉素和鏈霉素購自ICN Biomedicals；Annexin V/PI試劑盒、DCFH-DA和JC-1試劑盒購自凱基生物；PBS購自HyClone；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

2 方法

2.1 建立CoCl2損傷及TPO保護模型 根據CoCl2處理濃度(200、400、600、800、1 000 μmol/L)將PC12細胞共分為5組，每組處理時間為24 h。然后分別檢測CoCl2對PC12細胞存活率的影響，確定合適的損傷濃度。之后，根據TPO保護濃度將PC12細胞分為25、50、100、200、400 μg/L TPO+CoCl2損傷組，每組處理48 h后檢測TPO對CoCl2抑制PC12細胞存活率的影響，確定TPO保護的最佳濃度。

2.2 實驗分組 本實驗分組如下：(1)對照(control)組：用上述培養基培養，不加任何處理因素; (2)CoCl2組：加入500 μmol/L CoCl2到上述培養液中培養PC12細胞24 h；(3)CoCl2+TPO組：先加入500 μmol/L CoCl2處理PC12細胞24 h后，換成加入100 μg/L TPO培養液繼續培養PC12細胞48 h；(4)TPO組：于上述培養液中加入100 μg/L TPO培養PC12細胞48 h。

2.3 MTT法檢測細胞活力 取對數生長期細胞，接種于96孔板培養過夜后，更換為含有不同處理因素的培養基，處理結束后各組細胞分別加入MTT(5 g/L)20 μL，37 ℃溫箱孵育3～4 h，離心棄上清，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃溫箱孵育10 min后用酶標儀檢測各孔的吸光度(A)值(490 nm)，按公式：細胞存活率(%)=處理組A值/對照組A值×100%，求出各組的存活率，重復3次。計算并評價細胞存活率。

2.4 AnnexinⅤ/PI雙染法測定細胞凋亡率 各組細胞按實驗分組要求給予不同的因素處理后，離心收集細胞，預冷PBS洗2次，離心棄上清，用100 μL 1× AnnexinⅤ binding buffer重懸，調整細胞濃度為106個，取100 μL于試管中，加入5 μL的Annexin V-FITC和1 μL 100 mg/L的PI工作液，室溫避光反應15 min后加入400 μL的1×Annexin V binding buffer輕輕混勻，用流式細胞儀(Coulter)檢測細胞的凋亡率。激發波長488 nm; 發射波長530 nm。每次檢測均使用未經凋亡誘導處理的正常細胞作為對照，進行熒光補償的調節。

2.5 線粒體膜電位測定 各組細胞按實驗要求給予不同的因素處理后，離心收集細胞，用PBS洗滌細胞2次收集不多于1×106的細胞；取1× incubation buffer，混勻并預熱至37 ℃；取500 μL的1× incubation buffer加入1 μL的JC-1，漩渦混勻配成JC-1工作液；取500 μL的JC-1工作液將細胞均勻懸浮，37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育15～20 min；室溫離心(2 000 r/min，5 min)收集細胞，用1× incubation buffer洗2次；吸取500 μL的1×incubation buffer重新懸浮細胞，上流式細胞儀檢測。使用未經凋亡誘導處理的正常細胞作為陰性對照組和經凋亡誘導處理的凋亡細胞作為陽性對照組，進行熒光補償和設門調節。設定細胞取樣數為10 000個，Cell Quest軟件分析結果。同時取上述處理好的細胞在熒光顯微鏡(Nikon)下觀察拍照記錄結果。

2.6 細胞內活性氧簇水平測定 將PC12細胞接種于6孔板后按照實驗要求給予不同的因素處理，用無血清RPMI-1640培養液清洗2次。按照1∶1 000比例用無血清RPMI 1640培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA，于37 ℃細胞培養箱中避光孵育30 min，用無血清培養液充分清洗3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，采用熒光顯微鏡(Nikon)觀察、拍攝。

3 統計學處理

實驗數據用均數±標準差(mean±SD)的方式表示。利用SPSS 13.0對實驗數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)；組間數據的兩兩比較采用Student-Newman-Keulsq檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度CoCl2損傷對PC12細胞的毒性作用

在培養液中加入不同濃度的CoCl2(0、200、400、600、800、1 000 μmol/L)作用于PC12細胞24 h， MTT檢測結果顯示，CoCl2劑量依賴性地降低PC12細胞存活率。隨著CoCl2作用濃度的逐漸增大，可以引起PC12細胞存活率明顯降低，且呈明顯的量效關系(P<0.01)。600 μmol/L CoCl2作用PC12細胞24 h后細胞存活率下降，而400 μmol/L CoCl2所引起PC12細胞存活率偏高，結合預實驗結果，我們選擇中間值500 μmol/L濃度的CoCl2作為損傷濃度，見圖1A。

2 不同濃度TPO對抗CoCl2誘導的細胞毒性

為觀察TPO對抗CoCl2誘導PC12細胞毒性的作用，應用500 μmol/L濃度的CoCl2處理PC12細胞后，在培養液中分別加入不同濃度的TPO(25、50、100、200、400 μg/L)作用48 h，觀察TPO處理后對細胞存活率的影響。MTT檢測結果顯示，在25～100 μg/L的濃度范圍內，TPO呈濃度依賴性地抑制CoCl2引起的細胞毒性作用，其中100 μg/L的TPO保護作用達到峰值(P<0.01)，隨著TPO濃度的升高，其保護效果逐漸減小。在后續實驗中選擇100 μg/L的TPO作用48 h作為對抗CoCl2抑制PC12細胞生長的保護模型，見圖1B。

Figure 1.The effect of different concentrations of CoCl2 on the viability of PC12 cells (A) and the protective effect of different concentrations of TPO on the viability of PC12 cells after CoCl2 treatment (B). Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs 500 μmol/L CoCl2+0 μg/L TPO.

3 AnnexinⅤ/PI雙染法流式細胞術測定細胞凋亡率

用Annexin V/PI雙染法流式細胞術檢測各組不同處理的PC12細胞的凋亡情況，對照組和TPO組的凋亡率分別為6.13%和4.57%，CoCl2處理組的凋亡率顯著增加，達到23.06%(P<0.05)，CoCl2處理后再加用100 μg/L TPO 處理，其細胞凋亡率明顯降低至9.32%(P<0.05)，而100 μg/L的TPO本身不會引起PC12細胞的凋亡率改變，表明TPO有明顯的抗CoCl2誘導的細胞凋亡作用，見圖2。

Figure 2.The effect of TPO on the CoCl2 induced apoptosis of PC12 cells by flow cytometry. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs CoCl2 group.

4 線粒體膜電位的改變

采用JC-1熒光染色法觀察PC12細胞線粒體膜電位可見，對照組的PC12細胞在熒光顯微鏡下觀察到為紅色； TPO組也為紅色；CoCl2組在熒光顯微鏡下觀察到的PC12細胞為綠色； CoCl2+TPO 組PC12細胞在熒光顯微鏡下觀察呈橙色。采用流式細胞術檢測線粒體膜電位的變化。結果表明，PC12細胞在500 μmol/L CoCl2作用24 h后可見線粒體膜電位下降，比對照組及TPO組明顯降低(P<0.01)，TPO+ CoCl2能明顯抑制CoCl2引起的線粒體膜電位降低(P<0.01)，提示TPO對CoCl2引起的線粒體膜電位降低有抑制作用，見圖3。

Figure 3.The effect of TPO on CoCl2-induced decrease in MMP in the PC12 cells. A: the images of JC-1 staining; B: the images of flow cytometry; C: quantitative analysis of the data of flow cytometry. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group; ## P<0.01 vs CoCl2 group.

5 不同處理對細胞內活性氧簇變化的影響

利用DCFH-DA檢測PC12細胞內ROS的變化情況可見，ROS含量會隨著胞內熒光強度的增強而增多。結果表明，PC12細胞在500 μmol/L CoCl2作用6 h后，熒光顯微鏡下觀察發現與正常組比較細胞內熒光明顯增強；而TPO+CoCl2組能降低CoCl2引起的細胞內ROS的生成(熒光明顯減弱)，而TPO單獨作用不會引起胞內ROS水平的變化，見圖4。

討 論

TPO是重要的促血小板生成的造血生長因子，其蛋白結構和基因序列與促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)有23%的同源性，與腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)有36%的高度同源性。目前已有大量的體內外實驗證實EPO對神經細胞和心肌細胞具有保護作用[4]。我們課題組在過往的研究中也證實EPO有良好的神經保護作用，能穩定神經元胞膜，減少神經元的壞死和抗細胞凋亡[5]。TPO是否也具有相似的神經細胞保護功能？其作用機制是什么？研究表明TPO在體內與其受體(c-Mpl)結合后可通過數條細胞內信號轉導通路(如JAK-STAT通路、 MAPK通路和PI3K/Akt 通路)來調節和影響細胞的增殖、成熟和凋亡。而體內多種細胞中已發現存在c-Mpl，如中樞神經系統各部位中已證明有c-Mpl的廣泛表達[2，6]，體外研究表明TPO可以通過激活PI3K/Akt 這一通路來對抗無血清誘導C17.2細胞株的凋亡和促進細胞生長，發揮細胞保護作用[7-8]。本課題組也在新生大鼠缺血缺氧腦損傷模型的動物體內實驗中發現，在缺血缺氧早期使用TPO可以對缺血缺氧性腦損傷造成新生大鼠腦功能障礙起到治療和改善作用，減輕缺血缺氧對腦部發育的影響[3]。另有研究也發現在大腦中動脈梗塞的成年大鼠模型中，TPO可明顯減小皮層梗塞面積，改善感覺-運動神經功能[9]。

Figure 4.The inhibitory effect of TPO on CoCl2 -induced increase in intracellular reactive oxygen species (ROS) in the PC12 cells (DCFH-DA staining, ×200).

CoCl2是一種化學性低氧模擬劑，在體外培養的多種細胞中能模擬低氧/缺血狀況，CoCl2可增加細胞內ROS的生成，導致線粒體膜電位降低，進而引起細胞凋亡[10-11]。本研究結果也表明加入500 μmol/L CoCl2培養PC12細胞24 h后，該組細胞存活率下降，細胞內ROS生成增加，線粒體膜電位降低，出現凋亡的細胞數量明顯增加，與上述報道相符。目前研究認為，CoCl2誘導的神經細胞損傷與絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路有關，該家族成員有p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等。該信號轉導通路存在于大多數細胞內，在細胞轉化及凋亡等過程中具有至關重要的作用。有研究表明，化學性缺氧引起的神經元損傷由p38 MAPK通路介導[10]，JNK通路活化也參與化學性缺氧引起的神經損傷[11]，研究發現CoCl2能上調PC12細胞磷酸化ERK1/2蛋白的表達，而ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸預處理1 h可明顯拮抗CoCl2對p-ERK1/2表達的上調作用，提示CoCl2可導致細胞內ROS的大量堆積，ROS進而參與CoCl2對PC12細胞ERK1/2通路的激活作用。ERK1/2通路活化是化學性低氧劑(CoCl2)引起的細胞毒性、線粒體損傷及致凋亡作用的可能機制，并與p38MAPK通路存在相互激活的協同作用[12]。在缺氧/復氧誘導的大鼠原代皮層神經元凋亡的研究中也發現JNK蛋白磷酸化水平的升高與神經元凋亡率升高有關[13]。本研究結果表明，TPO能減輕CoCl2對PC12細胞的損傷作用，在先加入500 μmol/L CoCl2處理PC12細胞24h后，換成加入100 μg/L TPO培養液繼續培養PC12細胞48 h，發現該組細胞存活率上升，細胞內ROS生成減少，線粒體膜電位降低減少，出現凋亡的細胞數量明顯減少，該結果提示TPO對抗CoCl2誘導PC12細胞損傷的作用機制可能與其在與受體(c-Mpl)結合后通過MAPK信號轉導通路介導的效應有關，推測TPO能抑制p38MAPK通路，抑制JNK蛋白磷酸化，使ERK1/2通路去活化，阻止細胞凋亡的發生。

神經細胞能量幾乎完全來源于線粒體氧化磷酸化供能，故其對缺血缺氧極其敏感。線粒體跨膜電位的維持是其功能得以正常進行的前提條件。而線粒體內、外膜交界處的線粒體膜通透性轉換孔可受多種細胞死亡信號如 Ca2+超載、氧化應激等的作用而開放[14]，使線粒體膜電位無法維持，呼吸鏈斷裂。線粒體膜通透性的改變還能使線粒體基質Ca2+釋放，促凋亡因子(如細胞色素C)外漏到胞漿，進而啟動凋亡蛋白酶依賴及非凋亡蛋白依賴細胞凋亡途徑，引起細胞凋亡和死亡[15]。本研究結果顯示：采用JC-1熒光染色法觀察PC12細胞線粒體膜電位可見，對照組和TPO組的PC12細胞在熒光顯微鏡下觀察到均為紅色；表明這2組細胞線粒體膜電位水平較高，此時JC-1熒光染料形成聚合物，發出紅色的熒光；而 CoCl2組在熒光顯微鏡下觀察到的PC12細胞為綠色；表明CoCl2導致該組細胞線粒體膜電位水平降低，JC-1熒光染料以單體形式存在，發出綠色的熒光；在CoCl2+TPO 組PC12細胞在熒光顯微鏡下觀察呈橙色，表明TPO能明顯改善該組細胞線粒體膜電位的丟失，JC-1熒光染料大部分以聚合體形式存在，少數以單體形式存在，發出橙色的熒光。線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件，它發生在細胞核凋亡特征(染色質濃縮、DNA斷裂)出現之前，一旦線粒體膜電位不能維持，則細胞凋亡就不可逆轉。而TPO在與其受體(c-Mpl)結合后可通過數條細胞內信號轉導通路(如JAK-STAT通路、 MAPK通路和PI3K/Akt 通路)來調節和改變下游信號分子的活性，穩定線粒體膜通透性轉換孔，維持線粒體膜的通透性，進而維持線粒體膜電位的穩定，減少線粒體釋放促凋亡因子來對抗CoCl2誘導的細胞凋亡，發揮保護細胞的作用。

TPO在促血小板生成等造血系統外表現出的神經保護作用，表明其作用的多樣性，不可忽視。在腦出血和腦血管意外等疾病的治療中，TPO可能是比EPO副作用更小、更有效的治療藥物。進一步研究TPO神經保護的機制和有效劑量，對臨床上缺血缺氧性腦損傷治療有重要的意義。

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Effect of thrombopoietin on chemical hypoxia-induced apoptosis of PC12 cells

WANG Xiao-dong1, CHEN Mei-yuan2, ZENG Zhi3, ZHOU Zhuo-yan2, YANG Mo4

(1DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPhysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3DepartmentofPhysiology,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;4DepartmentofHematology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:zhuoyanzhou@126.com)

AIM: To study the effect of thrombopoietin (TPO) on chemical hypoxia-induced apoptosis of theRattusnorvegicusadrenal pheochromocytoma (PC12) cells. METHODS: The cultured PC12 cells were randomly divided into normal control group, cobalt chloride (CoCl2) group, CoCl2+TPO group and TPO group. The cell viability was mea-sured by MTT assay. The effect of TPO on CoCl2-induced cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V/PI double staining. The intracellular reactive oxygen species (ROS) were detected by fluorescence microscopy, and the changes of the mitochondrial membrane potential (MMT) were determined by flow cytometry and fluorescence microscopy. RESULTS: Chemical oxygen agent CoCl2significantly inhibited the growth of PC12 cells (P<0.01). The apoptotic rate in CoCl2group was obviously higher than that in control group (P<0.05), while the apoptotic rate in CoCl2+TPO group was obviously lower than that in CoCl2group (P<0.05). TPO decreased the production of ROS, and inhibited the decrease in MMP induced by CoCl2(P<0.01). CONCLUSION: TPO has a protective effect against CoCl2-induced apoptosis of PC12 cells by decreasing the production of ROS and inhibiting the decrease in MMP.

Thrombopoietin; Cobalt chloride; PC12 cells; Cell hypoxia; Cell apoptosis

1000- 4718(2015)03- 0409- 06

2014- 10 -22

2015- 01- 26

國家自然科學基金資助項目(No.81270580)

△通訊作者 Tel: 020-85220260; E-mail: zhuoyanzhou@126.com

R363.2； R338.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.005