SSAO介導的氧化脫氨反應對3T3-L1脂肪細胞的氧化應激作用*

張瓊麗， 羅紅軍， 李 慧， 林哲絢， 羅文鴻

(汕頭大學醫學院生物分析實驗室， 廣東 汕頭 515041)

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SSAO介導的氧化脫氨反應對3T3-L1脂肪細胞的氧化應激作用*

張瓊麗， 羅紅軍， 李 慧， 林哲絢， 羅文鴻△

(汕頭大學醫學院生物分析實驗室， 廣東 汕頭 515041)

目的： 觀察氨基脲敏感型胺氧化酶(SSAO)催化其底物甲胺(MA)和苯甲胺(BZA)的氧化脫氨反應對成熟3T3-L1脂肪細胞的氧化應激作用。方法: 3T3-L1前脂肪細胞誘導分化為成熟脂肪細胞；高效液相色譜法檢測不同分化天數下細胞SSAO活性的變化；MTT法檢測不同濃度的MA或BZA對細胞活力的影響；熒光探針方法檢測細胞在藥物作用下產生的活性氧；以0.5 mmol/L MA或BZA處理成熟脂肪細胞或未經誘導分化的前脂肪細胞4 h，觀察細胞產生的甲醛(FA)、苯甲醛(BZ)、脂質過氧化指標丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽(GSH)的變化。結果: SSAO活性隨細胞分化天數的增加而增加，并于第8天達到高峰；不同濃度MA或BZA作用細胞4 h對細胞活力無顯著影響(P>0.05)；0.5 mmol/L MA或BZA孵育后，細胞產生的活性氧增高，約為陰性對照組的3～4倍，差異有統計學意義(P<0.05)；在成熟脂肪細胞中，MDA的含量增加，而T-SOD和GSH的活性和含量減少，與陰性對照組相比，差別有統計學意義(P<0.05)；MA和BZA作用未經誘導分化的前脂肪細胞，其MDA和SOD和GSH的變化不明顯，差別無統計學意義(P>0.05)。結論: SSAO可能通過其介導的氧化脫氨反應引起3T3-L1成熟脂肪細胞產生氧化應激。

氨基脲敏感型胺氧化酶； 脂肪細胞； 甲胺； 苯甲胺； 氧化應激

大量的研究發現肥胖是糖尿病、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化等疾病發生發展的危險因素之一[1-4]，這可能與肥胖者體內氧化應激水平增高有關。研究表明氧化應激可以干擾胰島素誘導的3T3-L1脂肪細胞內的胰島素受體基質-1和磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的重分布，降低細胞膜上胰島素受體的敏感性，并使細胞葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT-4)表達減少，這些都與胰島素抵抗的發生有直接關系[5-6]。因此，探討脂肪細胞氧化應激的產生因素具有科學意義。

氨基脲敏感型胺氧化酶(semicarbazide-sensitive amine oxidase, SSAO)是一類催化胺類化合物氧化脫氨，含Cu2+，并以6-羥基多巴醌為輔酶，對氨基脲敏感的胺氧化酶的統稱。其反應底物主要是伯胺類化合物，催化產生相應的醛、過氧化氫及氨。有報道體內存在的甲胺，經SSAO催化生成的甲醛(formaldehyde，FA)、過氧化氫可通過協同增強氧化應激，造成血管內皮細胞損傷[7]。SSAO在成熟脂肪細胞中大量存在，且與細胞的分化程度有關。目前研究認為，SSAO在脂肪細胞中可參與葡萄糖的轉運，具有類胰島素的作用[8-10]。但其在脂肪細胞中的確切病理生理功能仍不甚清楚。由于成熟脂肪細胞高表達SSAO，而體內同時存在內源性底物(甲胺，氨基丙酮等)，因此，我們猜測SSAO可能參與了脂肪細胞的氧化應激。本文以3T3-L1脂肪細胞為模型，以甲胺、苯甲胺為底物探討SSAO在脂肪細胞中的病理生理意義。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

高糖DMEM培養基、胎牛血清( Hyclone)；青霉素-鏈霉素雙抗、BCA蛋白定量試劑盒(中國碧云天生物技術研究所)；胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescein 3’,6’-diacetate，DCFH-DA)、氯吉靈、帕吉林、苯甲胺(benzylamine，BZA)、甲胺(methylamine，MA)、2,4-二硝基苯肼(dinitrophenyl hydrazine，DNPH； Sigma)；油紅O、Triton X-100、胰蛋白酶(1∶250)(Amresco)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase， T-SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；3T3-L1前脂肪細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院。

2 方法

2.1 3T3-L1脂肪細胞的培養、誘導分化和鑒定 在37 ℃、飽和濕度、體積分數為5%的CO2條件下，3T3-L1前脂肪細胞培養于含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素-1×105U/L鏈霉素的高糖DMEM培養基中(基礎培養基)，每2～3 d換液，直到細胞生長到對數生長期時用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，進行細胞傳代或接種。

將細胞接種于細胞培養板中，大約2～3 d細胞長滿板底后，細胞接觸抑制開始，換新鮮的基礎培養基繼續培養48 h后，換以含有0.5 mmol/L IBMX、0.25 μmol/L地塞米松和10 mg/ L胰島素的基礎培養液(誘導分化液Ⅰ，此時為分化第0天)，60 h后更換僅含有10 mg/L胰島素的基礎培養液(誘導分化液Ⅱ)繼續培養60 h，之后每2 d更換1次基礎培養液，直到細胞誘導分化為成熟脂肪細胞。

油紅O染色法鑒定細胞：先吸棄培養基，用PBS漂洗細胞3次，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS漂洗3次，等細胞自然風干之后加入油紅O工作液，室溫下染色1 h，棄去染液，PBS漂洗，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX70-S1F2)下觀察，并拍照紀錄。

2.2 高效液相色譜法(HPLC)檢測3T3-L1脂肪細胞SSAO活性 將細胞接種于6孔培養板中，從細胞誘導分化開始，分別在第0、1、3、5、7、8、9、10天收集細胞，超聲破碎細胞，根據文獻方法[11]進行酶活性的檢測：取200 μL的細胞懸液于1.5 mL的EP管中，加入20 μL單胺氧化酶抑制劑，混勻，室溫下孵育30 min；加入180 μL的苯甲胺，混勻，37 ℃ 水浴1 h， 之后加入100 μL三氯乙酸(trichloracetic acid，TCA)(20%W/V)終止反應，12 000 r/min 離心8 min，取300 μL上清液于5 mL的玻璃離心管中，加入50 μL的DNPH(3 g/L)混勻1 min，40 ℃ 水浴15 min，之后用乙酸乙酯萃取2次，每次1 mL， 混勻后離心5 min， 取上層液于45 ℃ 下氮氣(N2)吹干，之后用500 μL乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解，上樣分析檢測。

2.3 MTT檢測細胞活性 將3T3-L1前脂肪細胞按1×104細胞每孔接種于96孔細胞培養板中，按上述細胞誘導分化方法將細胞誘導分化為成熟脂肪細胞，含0.5% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的DMEM(無血清)培養基孵育細胞6 h，之后換以含0.1 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、3 mmol/L的MA或BZA的無血清培養基分別孵育細胞4 h、12 h、24 h,以等體積溶劑作為陰性對照組，每組設5個復孔。孵育結束后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，繼續孵育4 h，吸棄培養基，每孔加入200 μL的二甲基亞砜(DMSO)溶解結晶，低速搖勻10 min后，酶標儀(Thermo)490 nm處測定吸光值(A)。按以下公式計算細胞活力：處理組A/對照組A×100%。

2.4 DCFH-DA檢測細胞的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的水平 將3T3-L1前脂肪細胞接種于24孔細胞培養板中，按上述方法誘導細胞分化為成熟脂肪細胞后，預孵含0.5% BSA的DMEM(無血清)培養基6 h，之后用不同濃度MA或BZA(0、0.1、0.25、0.5 mmol/L)與20 μmol/L DCFH-DA熒光染料共同孵育細胞1 h，PBS洗3次后，各孔加入500 μL 0.1% Triton X-100，搖床裂解10 min，收集裂解液，離心取上清。用熒光分光光度計(RF-5000，SHIMADZU)在485 nm激發波長和530 nm發射波長下檢測熒光強度。同時與未誘導分化的前脂肪細胞做對比。

2.5 甲醛或苯甲醛和脂質過氧化指標的檢測 將3T3-L1前脂肪細胞接種于6孔培養板中，按上述方法將細胞誘導分化為成熟脂肪細胞后，預孵含0.5% BSA的DMEM(無血清)培養基6 h，之后用含0.5 mmol/L MA或BZA的無血清培養基孵育細胞4 h，孵育結束后，在冰上，PBS洗3次，用細胞刮鏟收集細胞于1.5 mL的EP管中，3 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細胞，超聲破碎細胞，制成細胞懸液。

將細胞懸液按照參考文獻[11-12]的方法檢測細胞內甲醛(FA)或苯甲醛(benzaidehyde，BZ)的含量。取200 μL細胞懸液于帶蓋螺口玻璃瓶，加入800 μL雙蒸水，100 μL氨芐西林水溶液(2.5 g/L)和250 μL TCA，旋緊瓶蓋后振蕩30 s，90 ℃水浴1 h后；冰浴30 min，將瓶內物質完全轉移到離心管中，加入約0.5 g NaCl，振蕩1 min，2 000 r/min離心5 min，取上層液，用乙醚再萃取1次，合并2次萃取液于40 ℃下N2吹干，之后用500 μL乙腈-0.01%甲酸水溶液(50∶50，V/V)溶解，上樣分析檢測甲醛含量。取200 μL細胞懸液于1.5 mL的EP管中，加入200 μL PBS混勻后，加入100 μL TCA漩渦混勻30 s，12 000 r/min離心8 min，取300 μL上清液于離心管中，加入50 μL DNPH混勻1 min，40 ℃水浴15 min，之后用乙酸乙酯萃取2次，混勻后離心，取上層液于45 ℃下N2吹干，之后用乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解，上樣分析檢測苯甲醛含量。

將上述處理的細胞按MDA、T-SOD、GSH檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)上說明書的方法對樣本進行脂質過氧化指標的檢測和分析，不加藥的為陰性對照組，每組設3個復孔。同時與未誘導分化的前脂肪細胞做對比。

3 統計學處理

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 3T3-L1細胞誘導分化及鑒定

未誘導分化的前脂肪細胞呈現纖維型，胞質中不含脂滴(圖1A)；經誘導分化8 d左右，有95%以上的細胞呈現成熟脂肪細胞表型，細胞內有大量脂滴，并環繞于胞膜內，呈指環狀(圖1B)；經油紅O染色可見脂肪細胞內大量柚紅色顆粒(圖1C)。

Figure 1.Morphologies of 3T3-L1 cells. A: 3T3-L1 cells before differentiation; B: adipocyte of 8th d after differentiation; C: adipocytes stained with oil red O.

2 3T3-L1 細胞誘導分化過程中SSAO活性的變化

誘導分化的前3 d，酶活性無明顯變化，第5天開始，細胞的SSAO活性顯著升高，第8～9天，酶活性達到最高，之后又呈下降的趨勢，第8天和第9天差別無統計學意義，第3天之后的每一組均顯著高于未誘導分化組(第0天)(P<0.01)。本實驗細胞選擇誘導分化到第8天的細胞進行實驗，此時SSAO活性較高，見圖2。

Figure 2.The alteration of SSAO activity during 3T3-L1 cells differentiation. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 d.

3 SSAO底物MA和BZA對成熟脂肪細胞活力的影響

3 mmol/L MA孵育12 h和0.5、1及3 mmol/L MA孵育24 h均顯著降低細胞活力(P<0.05)；3 mmol/L BZA孵育4 h和12 h與0.1 mmol/L～3 mmol/L BZA孵育24 h也顯著降低細胞活力(P<0.05)。其余各濃度和時點的MA、BZA作用均對細胞活力無顯著影響(P>0.05)，見表1。

4 MA和BZA對3T3-L1細胞ROS產生的影響

和陰性對照組相比，0.1～0.5 mmol/L MA和BZA引起成熟脂肪細胞ROS顯著增加(P<0.05)，并呈劑量依賴性，0.5 mmol/L MA和BZA活性氧為陰性對照組的3倍左右。但和陰性對照組比較，0.5 mmol/L MA和BZA對未誘導分化的前脂肪細胞活性氧產生無顯著差異(P>0.05)。后續實驗選用無明顯細胞毒性的0.5 mmol/L的底物作用細胞4 h，見圖3。

表1 SSAO底物MA或BZA 作用4、12、24 h對脂肪細胞活力的影響

*P<0.05vs0 mmol/L group.

5 SSAO介導MA和BZA分別產生FA和BZ

0.5 mmol/L MA作用4 h細胞后，與陰性對照組相比，細胞產生的FA含量增加，差別有統計學意義(P<0.05)。0.5 mmol/L BZA作用4 h細胞后，細胞及培養基中BZ含量均增加，與對照組比較，差別有統計學意義(P<0.05)，見表2、3。

6 SSAO底物對成熟脂肪細胞和未誘導分化的前脂肪細胞MDA和T-SOD、GSH的影響

在成熟脂肪細胞中，與對照組相比，MA或BZA組對細胞MDA的產生、T-SOD活力和GSH含量變化都有顯著差異(P<0.05)，0.5 mmol/L MA和BZA顯著增加細胞MDA含量(P<0.05)，并降低T-SOD活力(P<0.05)。MA組MDA含量比對照組增加約3倍，BZA組約增加4倍；T-SOD活力均減少30%左右；MA處理過的細胞GSH含量比對照組減少約30%，BZA組減少一半左右。在未誘導分化的前脂肪細胞中，與對照組相比，MA和BZA組細胞MDA的產生、T-SOD活力和GSH含量均無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

討 論

SSAO主要以2種方式存在于人和動物的體內，一種是以游離形式存在于血液中，另一種是以膜結合型形式存在于組織中，尤以脂肪細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞的SSAO含量豐富[13-15]。本實驗表明，3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞在誘導分化為成熟脂肪細胞過程中，細胞表達SSAO增高從而表現出逐漸升高的酶活性，該實驗結果與以往報道相符[16]。SSAO的反應底物主要是伯胺類化合物，目前發現內源性底物有甲胺和氨基丙酮等。甲胺主要來源于體內肌酸、膽堿、腎上腺素代謝，也可從飲食或吸煙中攝入；而氨基丙酮則由蘇氨酸和甘氨酸代謝產生。甲胺在體內組織和尿液均有存在[17]。體內胺類物質并無明顯毒性，但胺在SSAO存在的情況下可產生活性氧及醛類[18]。甲醛可增強體內蛋白糖基化，引起DNA蛋白交聯，具有較強的細胞毒性，被認為與一些重大疾病相關。此外，它可以與過氧化氫發生協同作用造成血管內皮細胞損傷[7]。有研究證明SSAO及其代謝產物與內分泌或心血管疾病的發生密切相關，如糖尿病、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化等[19-21]。

Figure 3.Production of ROS after exposure of 3T3-L1 mature adipocytes to MA or BZA. Mean±SD. n=3. *P <0.05 vs 0 mmol/L group.

表2 SSAO介導其底物甲胺產生甲醛

*P<0.05vs0 mmol/L group.

表3 SSAO介導其底物苯甲胺產生苯甲醛

*P<0.05vs0 mmol/L group.

Figure 4.Effects of SSAO substrates MA,BZA on oxidative stress in the preadipocytes and adipocytes. After exposure to 0.5 mmol/L MA or BZA for 4 h, MDA(A), T-SOD(B) and GSH(C) in the adipocytes or preadipocytes were measured. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group．

機體代謝過程中可不斷地通過酶促反應或非酶促反應產生活性氧，在生理條件下，活性氧的生成和清除處于一個動態平衡的狀態。當體內受內源性或外源性刺激，可發生代謝異常，導致大量活性氧自由基產生或抗氧化物質不足，使生理條件下氧化與抗氧化系統間的動態平衡被打破，進而使機體處于氧化應激狀態，氧化損傷生物分子，進一步引起細胞死亡和組織損傷，這與很多病理過程相關，如肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化等[22]。肥胖相關的一些病癥是一個長期慢性的過程，而內源性胺類物質體內濃度不高，因此研究胺類物質的短期急性細胞毒性并無太大的臨床意義。本文通過MTT實驗確定一個在不顯著影響細胞活力的情況下[在較低的底物濃度(0.5 mmol/L)和較短的培養時間(4 h)]，研究藥物對細胞氧化應激的影響，看細胞內氧化應激系統的變化，包括氧化應激代謝產物中的脂質過氧化產物——丙二醛，抗氧化防御系統中的抗氧化酶——超氧化物歧化酶和非酶抗氧化劑——谷胱甘肽，這3個指標可從不同角度反映機體脂質過氧化程度和抗氧化能力的變化。細胞在處于氧化應激壓力下并不一定會快速出現活力下降或凋亡壞死，但氧化應激長期存在可能會通過改變細胞正常功能、影響細胞代謝等，從而影響機體健康。

本研究發現0.5 mmol/L MA或BZA可引起高表達SSAO的成熟脂肪細胞產生活性氧并可檢測到甲醛、苯甲醛代謝產物的生成，說明該過程中與SSAO的氧化脫氨反應有關。不同濃度BZA產生的細胞活性氧的量都比相應濃度的MA要稍微高些，這可能與BZA對SSAO的親和力比MA強有關。本研究通過進一步實驗發現0.5 mmol/L MA或BZA作用細胞4 h可引起MDA含量增高，說明細胞存在脂質過氧化；而T-SOD和GSH活性降低，表明脂肪細胞抗氧化能力下降。但這種現象在不表達SSAO酶活性的前脂肪細胞中并未出現。

本實驗中，在細胞活力還沒有顯著下降時，藥物可增強成熟脂肪細胞氧化應激，并通過高表達SSAO的成熟脂肪細胞和不表達SSAO的前脂肪細胞的氧化應激指標的對比，推斷SSAO介導的胺類底物氧化脫氨參與了脂肪細胞的氧化應激，從而有可能參與了脂肪細胞氧化損傷相關疾病的發生。

本實驗結果提示SSAO可介導其底物發生的氧化脫氨反應產生活性代謝物，從而引起細胞氧化應激損傷。該研究提示SSAO可能作為對抗脂肪細胞氧化應激損傷的靶點，可通過應用特異性SSAO抑制劑減緩與肥胖相關的代謝綜合癥的發生發展。

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NOD2通過IRF4抑制RICK和TRAF6的K63多聚泛素化而減輕結腸炎癥

現已證實，半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)活化和募集結構域15(recruitment domain 15, CARD15)基因(克羅恩病的主要危險因素)的多態性可導致核苷酸結合寡聚化結構域2(nucleotide-binding oligomerization domain 2, NOD2)功能喪失。然而，這種功能喪失是如何導致克羅恩病的易感性增加，其分子機制尚不清楚。已知人類樹突狀細胞中活化的NOD2可通過其配體胞壁酰二肽(muramyl dipeptide, MDP)減輕Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)介導的炎癥反應。Watanabe等發現，NOD2活化可使干擾素調節因子4(interferon regulatory factor 4, IRF4)表達增加，并與腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6, TRAF6)和受體相互作用絲氨酸-蘇氨酸激酶(receptor interacting serine-threonine kinase, RICK)結合。這種結合導致TRAF6和RICK的第63位賴氨酸(K63)相關多聚泛素化(polyubiquitination)被抑制，該抑制作用由IRF4介導，從而下調NF-κB的活化。該研究還證實，通過給予MDP或IRF4可以阻止小鼠實驗性結腸炎的進展，這種保護作用與小鼠結腸固有層單個核細胞中IRF4介導的TRAF6和RICK多聚泛素化的抑制有關。因此，這些發現可以解釋NOD2介導的針對腸道菌群的固有免疫應答的調節機制，并由此闡明CARD15多態性與所導致的NOD2功能紊亂在克羅恩病中的關系。

Mucosal Immunol, 2014, 7(6):1312-1325(周 晗)

Effect of deamination reaction mediated by semicarbazide-sensitive amine oxidase on 3T3-L1 adipocytes

ZHANG Qiong-li, LUO Hong-jun, LI Hui, LIN Zhe-xuan, LUO Wen-hong

(BioanalyticalLaboratory,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China.E-mail:whluo@stu.edu.cn)

AIM: To observe the effect of the metabolites generated from oxidative deamination of methylamine (MA) or benzylamine (BZA) catalyzed by semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) on 3T3-L1 adipocytes. METHODS: 3T3-L1 preadipocytes were induced to differentiation. SSAO activity was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) at different differentiation time points. MTT assay was applied to detect cell vitality after exposure to different concentrations of MA or BZA. Fluorescence probe DCFH-DA was used to determine the production of reactive oxygen species after incubation of 3T3-L1 adipocytes with MA or BZA. After exposure to 0.5 mmol/L MA or BZA for 4 h, malondialdehyde (MDA), total superoxide dismutase (T-SOD) and glutathione (GSH) in the adipocytes or preadipocytes were measured. RESULTS: SSAO activity increased with the increase in the differentiation days, and reached a maximum at the 8th day. Incubation of the cells with different concentrations of MA or BZA for 4 h did not significantly decreased the cell vitality (P>0.05). After exposure to 0.5 mmol/L MA or BZA, the reactive oxygen species in adipocytes significantly increased, and were about 3 to 4 times as compared with control group (P<0.05). After treatment with 0.5 mmol/L MA or BZA for 4 h, MDA content significantly increased, while the activity of SOD and the expression of GSH decreased in mature adipocytes compared with control group (P<0.05). However, MDA, T-SOD and GSH did not change significantly after treatment with equal molar of MA or BZA in the preadipocytes (P>0.05). CONCLUSION: MA or BZA induces oxidative stress in the mature adipocytes, which might result from the deamination products catalyzed by SSAO.

Semicarbazide-sensitive amine oxidase; Adipocytes; Methylamine; Benzene methylamine; Oxidative stress

1000- 4718(2015)03- 0468- 07

2014- 10- 16

2014- 11- 14

國家自然科學基金資助項目(No. 81170315); 廣東省自然科學基金團隊資助項目(No. 9351507102000-001)

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.015