Maxadilan對人脂肪干細胞的影響*

連瑞玲, 郭曉令, 郭永龍 , 劉 慶, 陳建蘇, , 3△

( 暨南大學 1附屬第一醫院眼科， 2再生醫學教育部重點實驗室， 3醫學院眼科研究所，廣東 廣州 510632)

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Maxadilan對人脂肪干細胞的影響*

連瑞玲1, 郭曉令2, 郭永龍2, 劉 慶1, 陳建蘇1, 2, 3△

( 暨南大學1附屬第一醫院眼科，2再生醫學教育部重點實驗室，3醫學院眼科研究所，廣東 廣州 510632)

目的： 探討垂體腺苷酸環化酶激活肽Ⅰ型受體(PAC1受體)特異激動劑maxadilan對人脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ASCs)的增殖、凋亡和分化潛能的作用。方法: 取人脂肪組織通過酶消化法分離培養ASCs。流式細胞術鑒定ASCs表面標志物，并進行ASCs向成骨成脂定向誘導。CCK-8法和流式細胞術檢測maxadilan對ASCs活性的影響。采用波長為254 nm的紫外線(ultraviolet C，UVC)照射ASCs，CCK-8法測定不同劑量的UVC誘導ASCs凋亡后的吸光度。選擇劑量為702 J/m2的UVC照射ASCs 24 h后，用流式細胞術和caspase 3和caspase 9試劑盒檢測maxadilan對ASCs凋亡的影響。結果: 流式細胞術檢測表明細胞CD29、CD44、CD59和CD105表面抗原陽性，證實所提取的細胞是ASCs。CCK-8法檢測發現80 nmol/L 濃度的maxadilan對ASCs 促增殖作用最強，流式細胞術分析也證實80 nmol/L maxadilan處理顯著促進ASCs的增殖，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。與僅被702 J/m2UVC照射的ASCs比較，80 nmol/L maxadilan 顯著抑制同等劑量UVC照射ASCs所誘導的、與caspase 3 和caspase 9活性相關的細胞凋亡，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。同時，2組細胞成骨和成脂的誘導分化均為陽性。結論: Maxadilan 促進ASCs增殖，抑制ASCs凋亡，且不改變細胞向成骨和成脂誘導分化的潛能。Maxadilan有利于ASCs的體外生長與擴增。

Maxadilan； 短波紫外線； 脂肪干細胞

人脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ASCs)來源于人體脂肪組織的基質成分中，具有間充質干細胞固有的生物學特性[1]。與其它來源的間充質干細胞相比較，由于它從通過微創手術獲取的組織中提取的量相對較多[2]，因此，在未來的再生醫學，軟組織修復，美容等領域有較大的需求[1]。但仍存在細胞來源有限，細胞提取易污染，擴增能力局限等問題。因此，尋找一種藥物作為ASCs培養液的添加劑來幫助其擴增是非常有必要的。

垂體腺苷酸環化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)是一種神經營養肽。有研究證明PACAP及其I型(PAC1)受體特異激動劑maxadilan能促進多種細胞的增生[3-4]。但目前文獻有關maxadilan對ASCs的作用報道尚不多見，本實驗通過maxadilan對ASCs處理，探討maxadilan對其增殖、凋亡及分化潛力的影響，為進一步開發ASCs的應用潛能提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

脂肪組織來源于暨南大學附屬第一醫院和華美整形美容醫院行抽脂手術的肥胖患者，標本采集均獲得當事人同意并簽訂知情同意書。Maxadilan由暨南大學生物工程研究所余榕捷教授惠贈。LG-DMEM培養基 (HyClone)；胎牛血清(Gibco)；0.25% 胰酶、膠原酶Ⅰ和青、鏈霉素(Life Technologies)；油紅O染色試劑盒(上海亞培生物科技有限公司)；蘇木精-伊紅染色液(舜田生物有限公司)；茜素紅染液(上海杰美基因醫藥科技有限公司)；caspase 3及caspase 9檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)； Annexin V-FITC試劑盒(深圳晶美生物有限公司)；CCK-8試劑盒(Vazyme)；CM-10便攜紫外觀察箱(上海熙浩實業有限公司)。

2 方法

2.1 脂肪干細胞的分離與培養 無菌條件下通過抽吸手術獲取患者腹部皮下脂肪組織并將其移入離心管，搖勻靜置分層，吸下層棄除，向離心管中加入與組織量等體積的PBS反復沖洗。然后用吸管吸取已預熱的0.1% I型膠原酶與脂肪組織等體積混勻，置于氣浴恒溫振蕩器(37 ℃、100 r/min)進行消化，振蕩50 min，1 291 r/min離心5 min。小心去除上清，加入0.3%氯化鈉重懸，放入培養箱裂解10 min。1 291 r/min離心5 min。去除上清，重復2次，用100目的篩網過濾，將濾液1 291 r/min離心5 min。用低糖培養基重懸細胞后，最后將其接種至50 mL培養瓶中。置入37 ℃、5% CO2恒溫培養箱進行培養，48 h后去除未貼壁的細胞，以后每3 d換液1次，待細胞貼壁達80%～90%，用0.25%胰蛋白酶對上述細胞消化，進行傳代培養。取第2代細胞進行相關檢測。

2.2 流式細胞術鑒定ASCs的表型標志 用0.25%胰酶消化ASCs，用PBS制作單細胞懸液，以3×105個細胞分別與抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD59、CD105和HLA-DR抗體于室溫下反應30 min，然后用PBS清洗2次，再與FITC標記的II抗避光反應15 min。將洗滌后的細胞用PBS重懸后，用流式細胞儀檢測分析。

2.3 CCK-8法檢測maxadilan處理對ASCs增殖的影響 用胰酶消化ASCs后，將其接種到96孔培養板上，每孔5×106/L細胞。培養板置于37 ℃、5% CO2培養箱，待細胞貼壁達80%～90%時，向以上培養板中分別加入濃度為0、60、80、100、120 nmol/L 的maxadilan, 不同濃度分別設定6個復孔，繼續培養24 h，每孔中分別加入10 μL CCK-8溶液，置于培養箱培養2 h后，使用多功能酶標儀測定各孔于波長450 nm的吸光度值(A)。

2.4 流式細胞術分析maxadilan處理對ASCs細胞周期的影響 1×109/L的ASCs接種于6孔培養板。實驗組培養液中添加80 nmol/L maxadilan，對照組不添加maxadilan，每組2個復孔。置于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h后，實驗組、對照組細胞用0.25% 胰蛋白酶消化5 min，收集細胞并用預冷的PBS洗滌1次，之后加入1 mL預冷的75%的乙醇，放置EP管內輕輕吹打混勻，4 ℃過夜后離心(2 000 r/min、10 min)棄上清，加入500 μL預冷的PBS，重懸，離心(2 000 r/min、10 min)，小心將上清液棄去，加入0.2 mL的碘化丙啶染液，室溫下避光反應15 min，用濾膜過濾，流式細胞儀分析細胞周期。

2.5 Maxadilan處理對ASCs細胞凋亡的影響 建立紫外線誘導ASCs的凋亡模型，用胰酶消化ASCs后，將其接種到96孔培養板上，每孔5×106/L細胞，待細胞貼壁達80%～90%時，向以上培養板中分別用劑量為0 J/m2(0 s)、117 J/m2(30 s)、234 J/m2(1 min)、468 J/m2(2 min)、702 J/m2(3 min)和936 J/m2(4 min)且波長為254 nm 的紫外線(即短波紫外線，ultraviolet C, UVC)進行照射，之后在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h，每孔中分別加入10 μL CCK-8溶液，置于培養箱培養2 h，使用多功能酶標儀測定各孔于波長450 nm的吸光度值。

將1×109/L的ASCs接種于6孔培養板。后續選用702 J/m2的UVC，并用80 nmol/L maxadilan處理細胞。細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h后，用0.25% 胰蛋白酶消化5 min，收集細胞，PBS清洗2次，1 000 r/min離心、5 min。 棄上清，加入200 μL binding buffer重懸細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，先加入200 μL binding buffer混勻，后加入5 μL PI染液染色，流式細胞術定量分析細胞的凋亡狀況。

2.6 檢測細胞內caspase 3及caspase 9活性 按流式細胞術定量分析細胞凋亡相同的方法分組和處理細胞，用0.25% 胰酶消化貼壁細胞，將其轉至新的培養液中，低速4 ℃離心5 min，去上清，PBS洗滌，加入裂解液(每200 萬個細胞加入100 μL裂解液)，輕搖勻使其重懸，置冰浴反應15 min，之后放入離心機，4 ℃、16 000 r/min離心15 min，取上清至預冷的EP管中，按說明書向96孔板中加入試劑后混勻， 每組3個復孔，置37 ℃、5% CO2培養箱過夜，待有明顯的顏色變化時，使用多功能酶標儀測定各孔樣品于波長405 nm的吸光度值，UVC單獨處理組與UVC+maxadilan組減法對照組吸光度即為樣品中caspase 3和caspase 9催化底物對應產生的吸光度。

2.7 ASCs在體外的成脂誘導 選取第2代細胞，用0.25% 胰酶消化后接種到6孔培養板上，每孔5×107/L細胞，在37 ℃、5% CO2條件下培養，待細胞貼壁達90%～100%后，將培養基更換為成脂誘導培養基(低糖DMEM，10% 胎牛血清，1% 雙抗，1 mmol/L地塞米松，10 mmol/L胰島素，0.5 mmol/L IBMX，200 mmol/L吲哚美辛, 同時添加80 nmol/L maxadilan孔作為實驗組，添加誘導培養基孔為對照組，每3 d更換1次培養基，繼續培養2 周后，分別取對照組和實驗組細胞依次進行油紅O和蘇木精-伊紅雙染，以證實2組細胞中是否有脂滴的形成。

2.8 ASCs在體外的成骨誘導 細胞處理方法同成脂誘導實驗，后更換成骨誘導培養基(低糖DMEM，10% 胎牛血清，1% 雙抗，10 mmol/L β-磷酸甘油鈉，0.1 μmol/L地塞米松，50 mg/L 2-磷酸化抗壞血酸)，只添加誘導培養基為對照組，另添加80 nmol/L maxadilan為實驗組，每3 d換1次液，誘導2 周后發現細胞出現大量的鈣化節，用PBS清洗細胞后用純丙酮固定15 min，茜素紅進行染色，在倒置顯微鏡下拍照。

3 統計學處理

所用資料為3次獨立實驗的結果。應用SPSS 13.0統計軟件建立數據文件，計量資料數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；多個實驗組與一個對照組比較，選用Dunnett法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 ASCs表型標志物的表達

流式細胞術檢測結果顯示細胞CD29、CD44、CD59和CD105表達呈陽性，提示分離的細胞具有間充質干細胞的特征；CD34、CD45和HLA-DR表達陰性，提示分離的細胞不是血源細胞，見圖1。

2 Maxadilan處理ASCs后細胞的增殖及細胞周期檢測

CCK-8法檢測結果顯示maxadilan可以促進ASCs增殖，其中，80 nmol/L 的maxadilan組比對照組細胞增多17%，差異有統計學意義(P<0.05)。流式細胞術的分析結果顯示：80 nmol/L maxadilan處理ASCs的細胞周期增殖指數(PI)為8.30%，與對照組5.13%相比，差異有統計學意義 (P<0.05)，表明經過80 nmol/L maxadilan處理的ASCs處于增殖期的細胞數增多，見圖2。

Figure 2.The effects of maxadilan on the viability of human ASCs. A: the effects of maxadilan at various concentrations on the viability of ASCs detected by CCK-8 assay; B: the effect of 80 nmol/L maxadilan on the proliferation of ASCs detected by flow cytometric analysis. Mean±SD. n= 3. *P<0.05 vs control.

3 Maxadilan對UVC照射ASCs凋亡后的作用

CCK-8法檢測分別暴露于117 J/m2、234 J/m2、468 J/m2、702 J/m2和936 J/m2的UVC對ASCs增殖的影響，未用UVC照射的ASCs作為對照組。234 J/m2、468 J/m2、702 J/m2和936 J/m2的UVC明顯抑制ASCs的增生，照射后的細胞比對照組分別減少10.8%、13.7%、18.1%和19.6%，差異有統計學意義(均P<0.05)。其后，ASCs先用maxadilan預處理，再照射UVC，細胞凋亡率比單獨使用UVC照射低，提示maxadilan對UVC照射ASCs凋亡有明顯的抑制作用，見圖3。

Figure 3.Establishment of UVC-induced human ASC apoptosis model and flow cytometric analysis of ASC apoptosis with different treatments. A: the effects of maxadilan on ASCs exposed to UVC at various dose; B: the percentage of apoptotic cells in ASCs exposed to 702 J/m2 UVC and treated with maxadilan at 80 nmol/L were measured by flow cytometric analysis. Mean±SD. n= 3. *P<0.05 vs control; ##P<0.01 vs UVC.

4 Maxadilan對UVC照射ASCs的caspase 3和caspase 9活性的影響

80 nmol/L maxadilan作用ASCs 24 h后，caspase 3的活性明顯降低，兩復孔值分別為0.081±0.001和0.078±0.002，與對照組0.050± 0.001 相比，有統計學意義(P<0.05)。同樣，caspase 9的活性明顯降低，兩復孔值分別為0.070±0.001和0.063±0.001，與對照組0.050±0.002 相比，有統計學意義(P<0.05)，表明maxadilan 對caspase 3和caspase 9具有下調作用。

5 Maxadilan對ASCs干性的影響

5. 1 ASCs對成脂誘導結果 第2代ASCs進行成脂誘導1 周后對照組和實驗組細胞均出現單獨存在的小脂滴，部分細胞含有多個小脂滴。誘導2 周后脂滴明顯變大，脂滴間相互融合變成大的脂滴，折光性很強。依次經油紅O和蘇木精進行雙染，可見細胞的胞漿中有許多大小不等的橙紅色脂滴，細胞核被蘇木精染成淺藍色，見圖4。

5. 2 ASCs對成骨誘導結果 第2代ASCs進行成骨誘導1 周后對照組和實驗組均發現細胞出現鈣化節，部分細胞含有鈣化現象類似細胞凋亡出現的碎片。誘導2 周后鈣化現象明顯，鈣化結節間相互融合，沙粒樣的物質增多。茜素紅染色后可見鈣化結構被染成紅色，見圖4。

Figure 4.Adipogenic and osteogenic differentiation of human ASCs in vitro. Scale bar=100 μm.

討 論

ASCs方便獲取，取材對器官損傷性小，使它成為一種比較理想的獲取干細胞的來源[2]。但是，ASCs較短的端粒酶、DNA的突變、衰老、凋亡等使得它的體外再生能力有限[5]。近來的研究發現：C型血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)、血小板源性的生長因子、骨形態生長因子、轉化生長因子β1(TGF-β1)、乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)、肺癌的可溶性因子、骨膜蛋白等可以促進ASCs的再生[6-9]。

PACAP是血管活性腸肽家族的一員，它有PAC1、VIP1和VIP2 3種受體[10]。Horvath等[11]發現PACAP可以促進人類增生性絨毛膜外滋養層細胞(human invasive proliferative extravillous cytotrophoblast cells，HIPEC)和視網膜全層細胞的再生。本研究團隊也曾發現PAC1受體可以通過其特異性激動劑maxadilan促進多功能干細胞的再生，且能抑制其凋亡[9]。但是該受體對ASCs的效應如何卻未見報道。本實驗首次證實PAC1受體的特異性激動劑maxadilan對ASCs具有促進增殖和抑制凋亡的作用。

凋亡是維持機體內環境穩態及正常細胞再生所必須的。而凋亡的機制多樣，了解ASCs的凋亡機制和maxadilan介導的抗凋亡機制，將有助于更深刻地理解ASCs的臨床應用。在參與凋亡過程的許多分子中，caspase扮演著一個重要的角色，它是一種惰性蛋白酶其多種亞型在各種凋亡的刺激下相互作用，相互影響。 Caspase 3就是caspase家族中一種典型的蛋白酶，而caspase 9對caspase 3激活起關鍵作用。Ying等[7]、Zhao等[12]和Matalia等[13]發現caspse 3和caspase 9參與了紫外線誘導的細胞凋亡且其活性增加。本研究證實，maxadilan可以通過減少caspase 3和caspase 9的活化，來起到抗ASCs凋亡的作用。為進一步了解maxadilan對ASCs分化潛能的影響，我們設立了用maxadilan處理的實驗組和未用maxadilan處理的對照組進行成骨和成脂的定向誘導，發現2組都可以誘導成功，提示maxadilan不會影響ASCs向成骨和成脂的定向分化潛能。

總之，我們的結果發現PAC1受體的特異性激動劑maxadilan能夠顯著增強ASCs的再生，減少紫外線誘導的ASCs凋亡。Maxa-dilan的抗凋亡機制與caspase 3和caspase 9的活性下調有關。同時maxa-dilan并不會影響ASCs的成骨和成脂的定向分化潛能。我們的研究揭示：在ASCs的培養中，maxadilan 可以成為一種抗凋亡的添加劑。

[1] Nae S, Bordeianu I, Stancioiu AT, et al. Human adipose-derived stem cells: definition, isolation, tissue-engine application[J]. Rom J Morphol Embryol, 2013, 54(4):919-924.

[2] Barba M, Cicione C, Bernardini C, et al. Adipose-derived mesenchymal cells for bone regeneration: state of the art[J]. Biomed Res Int, 2013, 2013:416391.

[3] Sang VL, Dean JY, Craig AM, et al. PAC1 and PACAP expression, signaling, and effect on the growth of HCT8, human colonic tumor cells[J]. Regul Peptides, 2002, 109(1-3):115-125.

[4] Eugene S, Victor M, Karen M, et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and vasoactive intestinal peptide (VIP) regulate murine neural progenitor cell survival, proliferation, and differentiation[J]. J Mol Neurosci, 2008, 36(1-3):79-88.

[5] Li Y, Yang X, Nie FF, et al. Biological characteristics of human adipose-derived stem cells and their response to periostininvitro[J]. Chin Med J (Engl), 2013,126(8):1491-1497.

[6] Alan Y, Tomer A, Jamie CZ, et al. Adipose-derived stem cells promote lymphangiogenesis in response to VEGF-C stimulation or TGF-β1 inhibition[J]. Future Oncol, 2011,7(12):1457-1473.

[7] Ying X, Cheng S, Wang W, et al. Effect of lactoferrin on osteogenic differentiation of human adipose stem cells[J]. Int Orthop, 2012, 36(3):647-653.

[8] Emily MC, Bo Ri S, Joseph PC, et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(25): 9786-9791.

[9] Taro S, Masaaki I, Yutaka M, et al. Local transplantation of human multipotent adipose-derived stem cells accele-rates fracture healing via enhanced osteogenesis and angiogenesis[J]. Lab Invest, 2010, 90(4):637-649.

[10]招志毅,陳建蘇,余榕捷,等.Maxadilan對誘導多能干細胞增殖的作用[J].中國病理生理雜志,2011,27(10):1982-1988.

[11]Horvath G, Reglodi D, Brubel R, et al. Investigation of the possible functions of PACAP in human trophoblast cells[J]. J Mol Neurosci, 2014,54(3):320-330.

[12]Zhao ZY, Yu RJ, Yang JY, et al. Maxadilan prevents apoptosis in iPS cells and shows no effects on the pluripotent state or karyotype[J]. PLoS One, 2012, 7(3)：e33953.

[13]Matalia H, Shetty R, Dhamodaran K, et al. Potential apoptotic effect of ultraviolet-A irradiation during cross-linking: a study onexvivocultivated limbal epithelial cells[J]. Br J Ophthalmol, 2012, 96(10):1339-1345.

Influence of maxadilan on human adipose-derived stem cells

LIAN Rui-ling1, GUO Xiao-ling2, GUO Yong-long2, LIU Qing1, CHEN Jian-su1, 2, 3

(1DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospital,2KeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEdu-cation,3InstituteofOphthalmology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:chenjiansu2000@163.com)

AIM: To investigate the effect of maxadilan, which specifically activates pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor (PAC1 receptor), on the proliferation, apoptosis and differentiation potential of human adipose-derived stem cells (ASCs). METHODS: ASCs from human adipose tissue were isolated by enzymatic digestion and cultured. ASCs were confirmed by the analysis of the markers for cell phenotypes by flow cytometry (FCM) and adipogenic/osteogenic induction. The effect of maxadilan on ASCs viability was analyzed by CCK-8 assay and FCM. ASCs were irradiated by ultraviolet C (UVC) at 254 nm and the absorbance of apoptotic ASCs induced by various doses of UVC was measured by CCK-8 assay. ASCs were exposed to 702 J/m2UVC for 24 h to induce apoptosis. The effect of maxadilan on ASC apoptosis was analyzed by FCM and the determination of caspase 3 and caspase 9 levels. RESULTS: Adipose-derived stem cells were confirmed by the detection of the positive expression of cell phenotypes including CD29, CD44, CD59 and CD105 by FCM. The data of CCK-8 assay revealed that ASCs treated with maxadilan (80 nmol/L) had the strongest ability of proliferation. The data of FCM also demonstrated that the addition of 80 nmol/L maxadilan to ASCs in experimental group markedly improved the proliferation capacity of the cells compared with control group (P<0.05). The apoptosis of ASCs exposed to 702 J/m2UVC was dramatically inhibited by the treatment with maxadilan (80 nmol/L). Such process involved the caspase signaling pathway including caspase 3 and caspase 9. There was statistical significance (P<0.05) between experiment group (ASCs irradiated by UVC and supplemented with maxadilan) and control group (ASCs only irradiated by UVC). Meanwhile, adipogenic and osteogenic differentiation potentials were both positive in experiment group and control group. CONCLUSION: Maxadilan promotes proliferation and inhibits apoptosis of the ASCs. The differentiation potential of ASCs toward adipogenic and osteogenic lineages wouldn’t be altered by maxadilan. Maxadilan would benefit to growth and expansion of ASCsinvitro.

Maxadilan; Ultraviolet C; Adipose-derived stem cells

1000- 4718(2015)03- 0475- 06

2014- 10- 10

2014- 11- 18

國家自然科學基金資助項目(No. 81371689)； 廣東省自然科學基金資助項目(No. S2013010013391)

△通訊作者 Tel: 020-85227363; E-mail: chenjiansu2000@163.com

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A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.016