鈣激活氯通道ANO1在小鼠心肌細胞的表達及其功能鑒定*

侯毅鞠， 許會靜， 張雲喬， 扈昕虹， 郝 峰

(吉林醫藥學院臨床生物化學檢驗教研室，吉林 吉林 132013)

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鈣激活氯通道ANO1在小鼠心肌細胞的表達及其功能鑒定*

侯毅鞠， 許會靜， 張雲喬， 扈昕虹， 郝 峰△

(吉林醫藥學院臨床生物化學檢驗教研室，吉林 吉林 132013)

目的： 探討鈣激活氯通道蛋白anoctamin 1 (ANO1)在小鼠原代培養心肌細胞中的表達及其功能特性。方法: 采用胰酶與膠原酶共同消化，聯合2次差速貼壁法獲得C57BL/6小鼠原代心肌細胞；并用免疫熒光染色法檢測α-橫紋肌肌動蛋白，以鑒定心肌細胞純度；應用RT-PCR檢測小鼠心肌細胞ANO1 mRNA的表達；免疫印跡檢測ANO1蛋白在小鼠心肌細胞的表達情況；應用熒光淬滅動力學實驗檢測ANO1鈣激活氯通道的功能特性。結果: RT-PCR結果表明原代培養的小鼠心肌細胞表達ANO1 mRNA。免疫印跡實驗結果顯示原代培養的小鼠心肌細胞表達ANO1蛋白。 熒光淬滅動力學實驗證實表達于小鼠心肌細胞的ANO1具有鈣激活氯通道典型的陰離子轉運功能特性。結論: ANO1在小鼠心肌細胞中有明確表達，并具有鈣激活氯離子通道特性，提示ANO1是鈣激活氯通道的分子基礎。

Anoctamin 1； 鈣激活氯離子通道； 心肌細胞

鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)是心肌主要的氯離子通道之一，與心肌細胞的電活動關系密切。CaCCs不僅參與心肌靜息電位的形成及動作電位的復極化過程，并且在急性心肌缺血、再灌注、心力衰竭等病理狀態下，CaCCs異常激活，形成瞬間內向電流，產生異常沖動，從而導致心律失常發生。由此，推測CaCCs可能成為治療心律失常的新靶點。目前研究發現，anoctamin 1 (ANO1) 能夠是CaCCs的分子基礎，通過ANO1能夠產生Ca2+激活的Cl-電流，進一步證實ANO1 蛋白是重要的CaCCs之一[1]。但是ANOl 蛋白是否在心肌表達，尤其是它是否作為心肌內源性CaCCs發揮作用，目前還沒有明確研究結論。因此，在本研究中，我們以小鼠原代培養心肌細胞作為研究對象，應用分子生物學、免疫熒光化學方法以及熒光淬滅動力學實驗，明確ANO1 在心肌細胞的表達，為深入研究該通道功能、明確與該通道相關各類疾病的機制、相關靶向治療藥物的研發提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF級C57BL/6 新生乳鼠，雌雄不限，1～3日齡，1.2～1.5 g，由吉林大學第二醫院實驗動物中心提供。

2 主要試劑

DMEM/F12基本培養基、胰蛋白酶、膠原酶、α-橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體、Cy3標記的羊抗小鼠 II 抗以及焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)均購自Sigma；anti-ANO1單克隆抗體及HRP 標記羊抗兔 IgG 購自 Santa Cruz；T16Ainh-A01購自Millipore；新生牛血清購自 Gibco； TRIzol、轉染試劑 Lipofectamine LTX 為 Invitrogen產品；逆轉錄試劑盒為 Fermentas產品；DL1000 DNA marker、dNTP、Taq DNA聚合酶是 TaKaRa產品；谷氨酰胺是武漢天源生物技術有限公司產品；異丙醇、氯仿是北京化學試劑公司產品；真核表達載體 pcDNA 3.1 YFP H148Q / I152 L 為本實驗室前期構建，所用引物由上海生工合成。

3 主要方法

3.1 心肌細胞培養 取新生乳鼠心臟，剝離出心房部分組織，剪成 0.5～1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，加入0.125%胰酶與膠原酶，37 ℃水浴。10 min后棄上清液，再次加入消化酶繼續消化。15 min后終止消化，收集細胞接種于培養皿進行2次差速貼壁，盡可能除去非心肌細胞。2～3 d后細胞穩定貼壁，此時換培養液，細胞備用。

3.2 心肌細胞形態學觀察及純度鑒定 倒置顯微鏡觀察培養皿內心肌細胞形態并拍照。4% 多聚甲醛固定細胞，2% BSA溶液封閉后加入α-橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體(1 ∶ 100)，濕盒4 ℃過夜。加入 Cy3 標記的羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶500)，倒置熒光顯微鏡下(Olympus)觀察，計算心肌細胞純度并拍照。

3.3 RT-PCR檢測ANO1表達 第1次換液為3 d后，體外培養心肌細胞呈現單層貼壁生長并融合成片。倒出培養液，每一培養皿中加入1 mL TRIzol 試劑，按 TRIzol 總RNA分離試劑盒說明書提取RNA。以總RNA為模板，oligo ( dt )為逆轉錄引物，在Super ScriptTMⅢ逆轉錄酶的作用下進行逆轉錄反應，合成cDNA，并以此cDNA為模板，進行PCR擴增。參照文獻[3]合成ANO1 引物序列，上游引物為5’-GGA CCT GGG CTA TGA GGT TCA G-3’，下游引物為5’-CAG CGC GTC CCC ATG GTA CTC-3’；內參照β-actin的上游引物為5’-CAT CCT GCG TCT GGA CCT G-3’，下游引物為5’-ATC TCC TTC TGC ATC CTG TC-3’。 基因擴增體系為94 ℃ 45 s， 60 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min，擴增40個循環。取RT-PCR產物10.0 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上(0.03% 溴化乙錠)電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統拍攝實驗結果。

3.4 免疫印跡檢測ANO1蛋白的表達 收集狀態良好的心肌細胞，PBS沖洗3次，加入100 μL蛋白裂解液充分裂解，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清，BCA蛋白質定量試劑盒測蛋白質濃度。加入上樣緩沖液后煮沸變性，冷卻后凍存備用。取變性蛋白樣品進行SDS-PAGE分離蛋白，電泳結束后將分離好的蛋白條帶轉移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST對PVDF膜室溫封閉2 h，以封閉非特異性結合位點。然后加入兔抗鼠ANO1單克隆抗體(1∶100)4 ℃過夜。TBST緩沖液漂洗，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG II抗(1∶500)，室溫孵育1 h。免疫反應完成后繼續用TBST洗膜，均勻加入化學發光底物到 PVDF 膜上，室溫孵育 1 min。于暗室中去除發光液，壓片，曝光 1 min，顯影、定影，采集圖像后分析ANO1蛋白的表達。

3.5 熒光淬滅動力學實驗簽定ANO1功能 將生長狀態良好的細胞消化傳代于黑壁透明的96孔板中，細胞數為每孔20 000，然后將細胞放入CO2培養箱中培養24 h，直到細胞長成單層。將 Lipofectamine LTX 和pcDNA 3.1 YFP H148Q/I152L滴加入含有心肌細胞的培養板中，36 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察YFP黃綠色熒光表達情況。以PBS洗滌細胞，加入含有 ionomycin(5 μmol/L)的高 I-溶液，利用鈣激活氯通道對陰離子的轉運功能以及YFP H148Q/I152L對 I-敏感的特點，在Ca2+激活CaCCs后，應用Fluostar 多功能酶標儀檢測通過ANO1轉運的I-，對小鼠心肌細胞內 YFP H148Q 蛋白黃綠色熒光的淬滅，并且按照每個點5 s的速度連續測定14 s，獲取熒光強度動態曲線。實驗設置ANO1特異抑制劑 T16Ainh-A01(10 μmol/L)溶液及不含ionomycin高 I-溶液作為對照，以此確定ANO1通道功能特性。

結 果

1 心肌細胞的分離與培養

采用胰酶與膠原酶共同消化，聯合 2 次差速貼壁法獲得較多 C57BL/6 小鼠原代心肌細胞，見圖 1。

Figure 1.Mouse cardiomyocytes were isolated and cultured for 48 h (×200).

2 心肌細胞的純度鑒定

α-橫紋肌肌動蛋白染色陽性心肌細胞見圖2，可觀察到明顯橫紋肌結構。α-橫紋肌肌動蛋白染色陽性率代表心肌細胞純度，為 95.81%。

Figure 2.Immunofluorescent staining of α-sarcomeric actin antibody (×400).

3 心肌細胞ANO1的mRNA表達

RT-PCR 結果表明，在 400 bp 附近出現特異性條帶，與預期的目的片段大小相符，見圖3。證實經原代分離培養的小鼠心肌細胞在 mRNA 水平上有 ANO1 的表達，并且目的基因電泳條帶的灰度值與 β-actin 近似，表明小鼠心肌細胞中 ANO1 在mRNA 水平表達穩定。

Figure 3.The mRNA expression of ANO1 in the mouse cardiomyocytes detected by RT-PCR.

4 ANO1 蛋白在小鼠心肌細胞的表達

小鼠 ANO1 蛋白大小為150 kD，根據 Western blotting 結果中蛋白marker 的位置，心肌細胞提取蛋白在分離膠相應的位置上可見預期大小的清晰條帶， 證明小鼠心肌細胞在蛋白水平表達ANO1，見圖4。

Figure 4.The protein expression of ANO1 in the mouse cardiomyocytes.

5 心肌細胞ANO1 的功能特性鑒定

YFP H148Q/I152L熒光淬滅實驗結果顯示，ionomycin 可使胞漿中鈣離子濃度迅速升高，繼而引起 CaCCs 開放，使細胞外溶液中高濃度的碘離子向胞內轉運，導致 YFP 蛋白熒光強度迅速下降(圖 5 A)，表明 ANO1 具有內向轉運 I-的功能，符合 CaCCs 功能特點。對照組由于缺乏 ionomycin，即沒有Ca2+的激活作用，ANO1沒有開放，所以YFP 蛋白熒光強度無明顯變化，表明心肌細胞 ANO1 的激活的確與鈣離子密切相關，加入 ANO1特異抑制劑 T16Ainh-A01，YFP 蛋白熒光強度同樣無明顯變化，更進一步明確心肌細胞內流的碘是通過 ANO1 實現的(圖5B)。上述結果一致表明，表達于小鼠心肌細胞的 ANO1 具有鈣激活和轉運碘離子的特性，符合經典 CaCCs，提示ANO1是鈣激活氯離子通道的分子基礎。

討 論

近年來，氯通道在心臟生理和病理過程中的作用已經受到越來越多國內外學者的重視。其中 CaCCs的動力學特性是依賴于細胞內Ca2+濃度變化，進而對心肌細胞電活動產生直接影響。尤其是當機體處于病理狀態，如急性心肌缺血再灌注、心力衰竭、心肌肥厚等可以引起細胞內鈣超載，CaCCs通道異常激活，形成異常沖動，導致心律失常[2]。2008年Nature[3]、Science[4]和Cell[5]同時報道，內源性CaCCs通道是由ANO1蛋白構成，這一發現為特定細胞和組織中研究氯離子通道的生理病理相關問題及其作用機制提供了新的研究平臺。

Figure 5.ANO1 assay based on the halide-sensitive YFP H148Q/I152L in the mouse cardiomyocytes. A: representative trace showed cell fluorescence quenching upon the addition of extracellular I plus ionomycin in the cells stably expressing ANO1; B: representative trace of control group.

ANO1是跨膜蛋白 anoctamin(也稱作 TMEM 16)家族中的一員，其功能尚不明確。目前已證明，ANO1蛋白在各種分泌上皮(如氣管上皮，唾液腺上皮)、視網膜和感覺神經元、胃腸道 Cajal 間質細胞、血管平滑肌等均有表達[6-7]，且作為 CaCCs 通道發揮重要作用。此外亦有文獻顯示，ANO1 在頭頸部及胃腸道等腫瘤中表達增加，而且與腫瘤的發生、轉移、侵襲關系密切[8]。新近已有學者發表關于ANO1蛋白在心肌細胞表達的研究結論[9]，為此我們通過本研究進一步驗證該結論，以確定ANO1作為心肌內源性 CaCCs 所發揮的重要作用。我們以原代培養獲得 C57BL/6 小鼠心肌細胞作為研究對象，應用 RT-PCR 檢測到小鼠心肌細胞 ANO1 在mRNA 水平穩定表達，通過免疫印跡實驗進一步證實小鼠心肌細胞存在 ANO1 蛋白的表達。利用熒光淬滅動力學實驗，驗證ANO1 蛋白的確具有 CaCCs 通道的功能特性。因此，我們認為小鼠心肌細胞中的 ANO1 是鈣激活氯離子通道的分子基礎。本研究所獲得的結論能夠為 CaCCs 通道功能研究、心臟相關疾病機制的進一步了解、抗心律失常及心肌保護藥物研發提供新靶點、新途徑和新方向。

目前，有關心臟氯通道的基因、分子結構、通道特性和生理功能，以及通道在心律失常等病理狀態下作用的研究都取得了重大的進步。但是，我們也清楚地看到由于通道結構的復雜性，對于通道的調節機制仍存在很多的未知，都是目前亟待解決的問題。因此，我們后續將在 ANO1 通道的分子結構、調節機制和特異性調控藥物等方面展開相應的研究。隨著研究水平的深入和科技的進步，人類必將會逐步揭示氯通道在心律失常中的作用機制，并尋找到對疾病更為有意義的預防和治療方法。

[1] Hartzell HC, Yu K, Xiao Q, et al. Anoctamin/TMEM16 family members are Ca2+-activated Cl-channels[J]. J Physiol, 2009, 587(Pt 10):2127-2139.

[2] 王 莉, 張海林. Ca2+激活Cl-通道功能及分子基礎研究進展[J]. 中國細胞生物學學報, 2012, 34(5):477-484.

[3] Yang YD, Cho H, Koo JY, et al. TMEM16A confers receptor-activated calcium-dependent chloride conductance[J]. Nature, 2008, 455(7217): 1210-1215.

[4] Caputo A, Caci E, Ferrera L, et al. TMEM16A, a membrane protein associated with calcium-dependent chloride channel activity[J]. Science, 2008, 322(5901): 590-594.

[5] Schroeder BC, Cheng T, Jan YN, et al. Expression cloning of TMEM16A as a calcium-activated chloride channel subunit[J]. Cell, 2008, 134(6):1019-1029.

[6] Sheridan JT, Worthington EN, Yu K, et al. Characterization of the oligomeric structure of the Ca2+-activated Cl-channel Ano1/TMEM16A[J]. J Biol Chem, 2011, 286(2):1381-1388.

[7] Kunzelmann K, Kongsuphol P, Chootip K, et al. Role of the Ca2+-activated Cl-channels bestrophin and anoctamin in epithelial cells[J]. Biol Chem, 2011, 392(1-2):125-134.

[8] 柏志全, 李春英, 李 媛, 等. 氯通道在華蟾酥毒基誘導的鼻咽癌細胞凋亡中起重要作用[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(5):833-837.

[9] Ye Z, Wu MM, Wang CY, et al. Characterization of car-diac anoctamin1 Ca2+-activated chloride channels and functional role in ischemia-induced arrhythmias [J]. J Cell Physiol, 2015, 230(2)：337-346.

Expression and identification of ANO1 in mouse cardiomyocytes

HOU Yi-ju, XU Hui-jing, ZHANG Yun-qiao, HU Xi-hong, HAO Feng

(DepartmentofBiochemistryLaboratory,JilinMedicalCollege,Jilin132013,China.E-mail: 1208254922@qq.com)

AIM: To explore the expression of anoctamin 1 (ANO1), one of calcium-activated chloride channels (CaCCs), in mouse cardiomyocytes and its functional properties. METHODS: The cardiomyocytes from the myocardial tissues of C57BL/6 mice were isolated with enzyme and purified by the differential adherent method. The cells were stained with monoclonal anti-sarcomeric actin and Cy3 to evaluate the purity of the myocardial cells. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of ANO1 in the mouse cardiomyocytes. The protein expression of ANO1 in the mouse cardiomyocytes was determined by Western blotting analysis. The fluorescence quenching kinetics experiment was used to identify the ion transport properties of ANO1 in the mouse cardiomyocytes. RESULTS: The results of RT-PCR confirmed that ANO1 was expressed in freshly isolated myocardial cells. The results of Western blotting clearly demonstrated the protein expression of ANO1 in primarily cultured myocardial cells. Fluorescence quenching kinetics experiment on freshly isolated single myocardial cell revealed a pronounced outward rectifying property of the ANO1. The functional properties were similar to the classic CaCCs. CONCLUSION: ANO1 expression was identified in the mouse myocardial cells. The function of CaCCs was generated by ANO1, suggesting that ANO1 is the molecular basis of CaCCs.

Anoctamin 1; Calcium-activated chloride channels; Cardiomyocytes

1000- 4718(2015)03- 0539- 04

2014- 10- 22

2014- 11- 18

國家自然科學基金資助項目(No. 81202031)；吉林省教育廳基金資助課題(No. 2013351)；2014年吉林省大學生創新創業訓練計劃；2013年吉林省大學生創新創業訓練計劃；吉林醫藥學院大學生科研基金資助課題(吉醫學科字[2012]第12號)

△通訊作者 Tel: 0432-64560538; E-mail: 1208254922@qq.com

R337.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.027