FK228和雷帕霉素協同促進人乳腺癌細胞凋亡和細胞周期阻滯*

彭曉丹， 諸夢露， 高綠芬, 劉婷婷， 劉 艷， 歐陽媛， 李若玢， 劉禮飛， 李 譯， 劉曉宇， 鄭曉鶴△, 林紹強,△

(1溫州醫科大學藥學院，浙江 溫州 325035； 2暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510632； 3浙江海正藥業集團有限公司，浙江 臺州 318000)

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·論 著·

FK228和雷帕霉素協同促進人乳腺癌細胞凋亡和細胞周期阻滯*

彭曉丹1▲， 諸夢露1▲， 高綠芬2, 劉婷婷1， 劉 艷2， 歐陽媛2， 李若玢2， 劉禮飛3， 李 譯3， 劉曉宇3， 鄭曉鶴3△, 林紹強1,2△

(1溫州醫科大學藥學院，浙江 溫州 325035；2暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510632；3浙江海正藥業集團有限公司，浙江 臺州 318000)

目的： 探討組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)FK228和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)特異性抑制劑雷帕霉素(rapamycin，Rapa)聯合應用對體外人乳腺癌細胞株生長和凋亡的影響及其可能的分子機制。方法: 以乳腺癌細胞系MDA-MB-435和MCF-7為研究對象，經不同濃度的FK228和雷帕霉素處理后，磺酰羅丹明B(SRB)比色法檢測腫瘤細胞的生長抑制率，計算兩藥的聯合指數；Western blotting檢測乳腺癌細胞中凋亡相關蛋白、周期調控蛋白以及核酸相關蛋白的表達；流式細胞術檢測細胞周期。結果: (1) FK228或雷帕霉素單獨使用時均抑制腫瘤細胞生長，抑制率與時間、劑量呈正相關；當總抑制率為50%～70%時聯合指數(CI)值小于1，提示兩藥聯合應用具有協同效應；(2) 聯合用藥后，凋亡蛋白表達較單藥使用組明顯升高(P<0.05)；同時，p-Akt 蛋白表達下降，活化的caspase-3表達上調；(3) 聯合用藥后，周期調控蛋白表達較單藥使用組明顯下降(P<0.05)，細胞周期阻滯在G2/M期；聯合用藥后出現更為顯著的H2AX的磷酸化和H3的乙酰化(P<0.05)。結論: FK228和雷帕霉素聯合給藥能協同促進人乳腺癌細胞凋亡和細胞周期阻滯，具有良好的抗腫瘤前景。

FK228； 雷帕霉素； 乳腺癌； 協同作用

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，是全世界排名第二的腫瘤疾病，每年有近50萬女性患者死于乳腺癌[1]。盡管乳腺癌的診斷和治療水平有很大的提高，但是乳腺癌的發病率和死亡率仍然相對較高，這就需要我們進行更多的研究，開發更好的治療方法用于乳腺癌的治療，提高患者的生存質量和延長患者的生存期[2]。

FK228是從紫色素桿菌發酵產物中分離得到的環四肽類組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylases inhibitors，HDACi)，是新型的抗腫瘤藥物[3]。FK228能夠選擇性殺傷腫瘤細胞，改變細胞染色體結構，導致連接DNA的組蛋白乙?；辜毎芷谕?，同時能引起DNA損傷，最終導致細胞凋亡[4]。在體外實驗中，FK228單獨用藥對多種腫瘤細胞如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、黑色素瘤和前列腺癌細胞等具有很強的殺傷作用。體外研究結果表明，FK228與其它抗腫瘤藥物聯合，表現出更好的抗腫瘤效應[5-6]。

雷帕霉素(rapamycin, Rapa)是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的特異性抑制劑，是番薯鏈霉菌中提取出來的大環內酯類免疫抑制劑[7]。在動物實驗及臨床應用中發現，雷帕霉素是一種療效好，低毒，無腎毒性的新型免疫抑制劑并有抗腫瘤作用[8-9]。在乳腺癌治療中，mTOR抑制劑結合激素治療表現出顯著的治療效果[10]。mTOR信號通路PI3K-AKT-mTOR與腫瘤的發生、發展密切相關。Kumar等[11]研究發現，PI3K能夠維持DNA穩定性以及修復DNA損傷。

FK228和雷帕霉素在影響DNA和調控細胞周期蛋白方面具有不同的抗腫瘤機制，由此我們推測兩者可能在抗腫瘤作用上具有協同作用。本文就FK228和雷帕霉素對乳腺癌細胞的作用進行了體外研究，并探究這2種藥物的協同作用，為臨床聯合用藥治療乳腺癌提供了一定的理論依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

乳腺癌MDA-MB-435及MCF-7細胞株購自ATCC；DMEM培養基、L15培養基、胰蛋白酶及胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco；磺基羅丹明B鈉鹽、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、碘化丙啶(pyridine iodide, PI)、雷帕霉素購自Sigma；FK228由浙江海正藥業股份有限公司王繼棟博士饋贈；caspase-3 活性檢測試劑盒購自碧云天；Bcl-2 抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、cyclin D1抗體、cyclin E抗體、β-actin 抗體和鼠Ⅱ抗、兔Ⅱ抗均購自Santa Cruz；anti-acetyl-histone H3、anti-phospho-histone H2AX購自Millipore；cleaved-PARP購自Cell Signaling。

2 主要儀器

DL-CJ-1N醫用超凈工作臺；Olympus CK40倒置相差顯微鏡；Model550酶標儀(Bio-Rad)；流式細胞儀(BD)；曝光儀(Bio-Rad)。

3 方法

3.1 細胞培養 乳腺癌細胞株MDA-MB-435用含10% FBS的L15培養基、MCF-7用含10% FBS的DMEM培養基，在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養，細胞呈貼壁生長。

3.2 磺酰羅丹明B(sulforhodamine B, SRB)比色法 MDA-MB-435、MCF-7以每孔5×103個細胞接種于96 孔板中，常規培養24 h。實驗分為4組：FK228組、雷帕霉素組、聯合組、正常對照組(藥物溶劑對照)。FK228組藥物濃度以100 nmol/L為最高濃度，4倍梯度稀釋，設5個濃度；雷帕霉素組藥物濃度以1 800 nmol/L為最高濃度，2倍梯度稀釋，設5個濃度；聯合組為單獨給藥組的藥物聯合。各組各濃度分別設3個復孔，實驗重復3次。藥物作用24 h、48 h、72 h后分別用SRB法檢測細胞抑制率，采用聯合指數( combination index，CI)表示。抑制率按公式：細胞的增殖抑制率(%)=[對照組A值-實驗組A值]/對照組A值×100%。CI值的計算參見參考文獻[12-13]。

3.3 流式細胞儀測定細胞周期 MDA-MB-435、MCF-7以每孔4×105個細胞接種于6孔板中，常規培養24 h。實驗分4組：FK228組、雷帕霉素組、聯合組、正常對照組(藥物溶劑對照)，培養24 h后，用冷PBS 洗滌2 次，收集各組處理后的細胞，用冰預冷的75% 乙醇固定，PBS 洗滌、離心，加入含有0.1% RNaseA 的PBS 于37℃水浴1 h后用含10 mg /L PI的PBS染色至少20 min后，流式細胞儀檢測細胞周期。

3.4 Western blotting檢測細胞相關蛋白表達 MDA-MB-435、MCF-7以每孔4×105個細胞接種于6孔板中，常規培養24 h。實驗分4組：FK228組、雷帕霉素組、聯合組、正常對照組(藥物溶劑對照)，繼續培養48 h。細胞裂解液裂解細胞提取蛋白，用12% SDS-PAGE進行蛋白分離，將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉后，加入Ⅰ抗，4℃孵育過夜，TBST 洗滌，再加對應的Ⅱ抗，孵育1 h，TBST 洗滌。加入ECL顯影液，用凝膠成像儀進行拍照記錄。

3.5 Caspase-3活性檢測 MDA-MB-435、MCF-7以每孔4×105個細胞接種于6孔板中，常規培養24 h。實驗分4組：FK228組、雷帕霉素組、聯合組、正常對照組(藥物溶劑對照)，培養48 h 后，收集細胞，加入裂解液在冰上裂解細胞10 min。按照試劑盒操作說明加入各反應體系，37℃孵化2 h，在405 nm處測定吸光度。

4 統計學處理

實驗數據用均數±標準差( mean±SD)表示。采用SPSS 11.5統計軟件進行統計學分析，組間數據比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 單獨應用FK228與雷帕霉素和聯合應用兩藥對乳腺癌細胞生長的影響

FK228在較低濃度就具有較強的殺傷作用，濃度增加，抑制率逐漸增強，并且聯合給藥組抑制率大于單獨給藥組(P<0.05)。FK228、雷帕霉素對乳腺癌細胞MDA-MB-435、MCF-7體外的抑制作用隨時間推移抑制率增加，見圖1。

Figure 1.The inhibitory rate of MCF-7 and MDA-MB-435 treated with FK228,Rapa and FK228 combined with Rapa. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsFk228+Papa.

圖1 FK228、雷帕霉素以及兩者聯合用藥后MCF-7和MDA-MB-435細胞的抑制率

2 FK228與雷帕霉素合用的CI值

CI=(D)A/(Dx)A+(D)B/(Dx)B+(D)A×(D)B/[(Dx)A×(Dx)B]。其中(D) A 為藥物A在聯合應用A、B兩藥產生效應x時A藥的濃度；(D) B為藥物B在聯合應用A、B兩藥產生效應x時B藥的濃度；(Dx) A 為藥物A單獨產生效應x時A藥的濃度；(Dx) B為藥物B單獨產生效應x時B藥的濃度。CI值大于1時兩藥拮抗，小于1時協同。本實驗中，在總抑制率為50%～70%時的CI值小于1，協同效應顯著，由此顯示FK228與雷帕霉素的協同作用明顯，見圖2。

Figure 2.The CI of MCF-7 and MDA-MB-435 for the drug treatments at 30% effective dose(ED30), ED50 and ED70. Mean±SD.n=3.

圖2 在ED30、ED50和ED70時MCF-7和MDA-MB-435細胞的CI值

3 FK228和雷帕霉素聯合給藥促進乳腺癌細胞凋亡

蛋白水平檢測顯示，與對照組相比，MCF-7和MDA-MB-435細胞中FK228和雷帕霉素單獨作用時誘導促凋亡蛋白cleaved-PARP表達增多，caspase-3活性升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，下游通路中Akt的磷酸化水平降低，聯合用藥時較單獨用藥更為顯著，見圖3。

4 FK228和雷帕霉素聯合給藥使乳腺癌細胞周期調控蛋白改變

蛋白水平檢測顯示，與對照組相比，MCF-7和MDA-MB-435細胞中FK228和雷帕霉素單獨作用時調控細胞周期蛋白cyclin A和cyclin D1有所降低，聯合用藥時較單獨用藥更為明顯，見圖4。流式結果顯示在MCF-7細胞中當FK228單獨作用時出現了G2/M期的上升，而雷帕霉素單獨作用時并無G2/M期的上升，聯合用藥后G2/M期的上升較單獨用藥更為明顯，在MDA-MB-435細胞中FK228和雷帕霉素單獨作用時均出現了G2/M期的上升，聯合用藥后G2/M期的上升較單獨用藥更為明顯，見圖5、表1。綜上所述，FK228和雷帕霉素聯合給藥后乳腺癌細胞出現更加顯著的G2/M期阻滯。

Figure 3.The effect of FK228(2 nmol/L) or/and Rapa(500 nmol/L) on the expression of cleaved-PARP, Bcl-2, p-Akt and caspase-3 activity in MCF-7 and MDA-MB-435 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFK228+Rapa.

圖3 FK228、雷帕霉素以及兩者聯合用藥后MCF-7和MDA-MB-435細胞凋亡蛋白的表達

Figure 4.The expression of cyclical proteins in MCF-7 and MDA-MB-435 cells treated with FK228(2 nmol/L), Rapa(500 nmol/L)and FK228 combined with Rapa using Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFK228+Rapa.

圖4 MCF-7和MDA-MB-435細胞在FK228、雷帕霉素以及兩者聯合用藥后周期蛋白的表達

Figure 5.The detection of cell cycle in MCF-7 and MDA-MB-435 cells treated with FK228(2 nmol/L),Rapa(500 nmol/L)and FK228 combined with Rapa using flow cytometry.

圖5 MCF-7和MDA-MB-435細胞在FK228、雷帕霉素以及兩者聯合用藥后的流式周期分析

5 FK228和雷帕霉素聯合給藥促進DNA損傷

H2AX蛋白的磷酸化和H3的乙酰化會導致DNA損傷。與對照組相比，MCF-7和MDA-MB-435細胞中FK228單獨作用時出現H2AX的磷酸化和H3的乙?；?，雷帕霉素單獨作用時沒有明顯H2AX的磷酸化和H3的乙酰化，但兩者聯合用藥后出現更為顯著的H2AX的磷酸化和H3的乙?；Ｓ纱苏f明FK228和雷帕霉素聯合給藥后能更顯著地促進DNA損傷的產生，見圖6。

表1 MCF-7和MDA-MB-435細胞在FK228、雷帕霉素以及兩者聯合用藥后的流式周期分析

Table 1.The detection of cell cycle in MCF-7 and MDA-MB-435 cells treated with FK228 (2 nmol/L), Rapa (500 nmol/L) and FK228 combined with Rapa using flow cytometry (%. Mean±SD.n=3)

GroupG0/G1SG2/MMCF-7 Control64.20±3.4220.10±1.9110.90±1.34 FK22866.90±5.7510.80±3.4418.00±1.36*# Rapa75.20±4.6212.70±2.019.90±1.91# FK228+RAPA63.70±3.5710.40±2.0423.30±2.56*MDA-MB-435 Control74.50±2.999.70±2.7712.00±1.29 FK22864.80±4.2210.60±1.2221.50±3.64*# Rapa67.90±1.8912.60±1.5316.60±1.52*# FK228+Rapa59.60±1.3810.27±3.7129.80±4.66*

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFK228+Rapa.

Figure 6.The expression of DNA repair proteins in MCF-7 and MDA-MB-435 cells treated with FK228 (2 nmol/L), Rapa (500 nmol/L) and FK228 combined with Rapa. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFK228+Rapa.

圖6 MCF-7和MDA-MB-435細胞在FK228、雷帕霉素以及兩者聯合用藥后DNA蛋白水平的表達

討 論

實驗證明，FK228聯合雷帕霉素能協同殺傷人乳腺癌細胞(MDA-MB-435、MCF-7)。FK228在其單獨用藥或與雷帕霉素聯合用藥均具有很強的抑制腫瘤細胞生長作用，并呈時間、劑量依賴性；同時，FK228聯合雷帕霉素增強p-H2AX和ac-H3等一些DNA損傷修復蛋白的表達。p-H2AX能在早期反應DNA雙鏈的損傷，隨著DNA損傷的嚴重程度，p-H2AX呈線性增加，其中H2AX絲氨酸139以其獨特的羰基末端結構能在1～3 min左右對DNA損傷作出應答[14]。p-H2AX的持續激活，說明真核細胞受到藥物或者外界刺激，其雙鏈DNA開始受到損傷，并導致細胞凋亡[15]。FK228作用于DNA組蛋白，使其乙?；绊懻５霓D錄[16]，引起DNA損傷。從實驗結果顯示，在FK228與雷帕霉素聯合作用后，pH2AX的激活較單獨用藥更加顯著，說明FK228和雷帕霉素聯合用藥在一定程度上增強了DNA損傷介導的細胞凋亡。雷帕霉素是mTOR特異性抑制劑，其抑制腫瘤細胞生長的機制主要為影響因子的受體-PI3K-PTEN-Akt- mTOR(Raptor) 通路[17-18]，PI3K、PTEN以及Akt 與DNA損傷修復有關[19]。在實驗結果中，FK228與雷帕霉素聯合作用后，Akt磷酸化水平明顯降低，而兩者單獨用藥時沒有表現出明顯磷酸化水平改變。在乳腺癌細胞或者其它腫瘤細胞中，p-Akt水平變化可以作為雷帕霉素及其衍生物作用效果的重要標記[20]。因此我們推測，FK228與雷帕霉素可能協同影響Akt上游通路，共同誘導影響Akt的磷酸化，影響DNA損傷修復，抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡。

在許多腫瘤細胞中，HDACi包括FK228能下調細胞周期調控基因p21的表達，并且阻斷細胞周期蛋白/CDK的表達，導致細胞周期阻滯，抑制細胞生長[21]。雷帕霉素及其衍生物能特異性地結合到mTOR，抑制細胞周期過程中特異性mRNA的轉錄，阻斷細胞從G1進入到S期，從而影響細胞代謝，導致細胞周期阻滯于G2/M期，最終誘發凋亡[22]。流式結果中發現，FK228和雷帕霉素在單獨用藥時，均出現不同程度的G2/M期阻滯，聯合用藥時表現出更顯著的周期阻滯。在周期相關蛋白檢測中發現兩者聯合給藥后，出現了明顯的周期相關蛋白Cyclin A、Cyclin D1的表達下調。在我們研究中發現，FK228與雷帕霉素的協同作用中主要以FK228的作用為主，雷帕霉素單用沒有顯著的周期阻滯作用，這可能與選擇的用藥劑量有關。

本研究中， FK228與雷帕霉素聯合作用后誘導促凋亡蛋白cleaved-PARP剪切增多，同時caspase-3 表達上升，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，這些信號通路的增強或減弱都促進了腫瘤細胞凋亡，說明兩者聯合用藥后其殺傷腫瘤細胞作用更加顯著。

FK228以及雷帕霉素這兩個特異性抑制劑是目前具有研究前景的抗癌藥物，尤其是針對非實體瘤。FK228作為孤兒藥，用于治療皮膚T細胞淋巴瘤于2009年11月獲得FDA批準上市，2011年FK228治療外周T細胞淋巴瘤也獲得批準[15]。mTOR抑制劑雷帕霉素在臨床器官移植患者中廣泛使用，有較好的臨床用藥經驗[23]，同時mTOR信號通路的異常失調也可能與腫瘤或者人類其它疾病相關[24]。最近研究發現, 雷帕霉素及其衍生物CCI-779[25]、RAD001[26]和AP-23573[27]對包括乳腺癌在內的多種腫瘤細胞具有廣泛的抗腫瘤作用。但是，由于FK228和雷帕霉素的信號通路及其作用機制的復雜性，它們在治療乳腺癌中的進展受到一定程度的限制。在本次研究中，FK228和雷帕霉素聯合用藥對于乳腺癌細胞起到更加顯著的抑制效果，它們的抑制腫瘤細胞生長作用比單獨使用其中任何一種治療效果要強。雷帕霉素還可以提高細胞毒素劑的效果。我們的研究成果提供了它們在體外實驗聯合用藥的依據。

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Combination therapy of FK228 with rapamycin synergistically promotes human breast cancer cell apoptosis by DNA damage and cell cycle arrest

PENG Xiao-dan1, ZHU Meng-lu1, GAO Lü-fen2, LIU Ting-ting1, LIU Yan2, OU-YANG Yuan2, LI Ruo-fen2, LIU Li-fei3, LI Yi3, LIU Xiao-yu3, ZHENG Xiao-he3, LIN Shao-qiang1, 2

(1WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;2TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;3ZhejiangHisunPharmaceuticalCompany,Taizhou318000,China.E-mail:tlshq@jnu.edu.cn;zhengxh@hisunpharm.com)

AIM: To investigate the depressant effect of FK228 combined with rapamycin on the human breast cancer cell line MCF-7 and MDA-MB-435. METHODS: FK228, a new histone deacetylase inhibitor, and rapamycin, the specific inhibitor of the mammalian target of rapamycin (mTOR) protein, were used in the study. MCF-7 cells and MDA-MB-435 cells were exposed to different concentrations of FK228 and rapamycin. The inhibitory rate of cell growth was determined by SRB assay. Combination index (CI) was used to evaluate the interaction between FK228 and rapamycin. The expression of the apoptotic proteins, cycle proteins and nucleic acid proteins were detected by Western blotting. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. RESULTS: Both FK228 and rapamycin showed growth inhibitory effects on the breast cancer cell lines in a time- and dose-dependent manner. CI of the 2 drugs was less than 1 when the inhibitory rate of the cell growth was 50% effective dose (ED50)～ED70, indicating a synergistic effect. The combination therapy of FK228 with rapamycin increased the apoptotic proteins, and induced the down-regulation of phosphorylated Akt and over-expression of caspase-3 compared with a single use of the drugs. The combination therapy of FK228 with rapamycin reduced the cycle proteins, and the cell cycle was arrested in G2/M. The levels of phosphorylated H2AX and acetylated H3 were ob-viously increased after combination therapy. CONCLUSION: The combination therapy of FK228 with rapamycin inhibits the cell proliferation and increases apoptosis with a synergistic effect, which may become a new trend for treating endometrial cancer.

FK228; Rapamycin; Breast cancer; Synergistic effect

1000- 4718(2015)04- 0577- 08

2014- 12- 26

2015- 01- 27

國家自然科學基金資助項目(No. 81071751; No. 81172074)；暨南大學附屬第一醫院科研啟動基金(2012)資助項目(No.11614103)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.001

△通訊作者 林紹強 Tel: 020-38688511; E-mail:tlshq@jnu.edu.cn; 鄭曉鶴 Tel: 0576-88828271; E-mail:zhengxh@hisunpharm.com

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