IL-8促進(jìn)A549細(xì)胞遷移過程中對(duì)線粒體融合與分裂基因表達(dá)的影響*

張 鈺， 高宇飛， 蘇 靜， 于春艷， 賀宜春， 孫連坤△

(1吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 長春 130021; 2吉林大學(xué)白求恩第三醫(yī)院神經(jīng)外一科，吉林 長春 130033； 3北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

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IL-8促進(jìn)A549細(xì)胞遷移過程中對(duì)線粒體融合與分裂基因表達(dá)的影響*

張 鈺1， 高宇飛2， 蘇 靜1， 于春艷3， 賀宜春2， 孫連坤1△

(1吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 長春 130021;2吉林大學(xué)白求恩第三醫(yī)院神經(jīng)外一科，吉林 長春 130033；3北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

目的： 探討IL-8作用下人肺腺癌A549細(xì)胞的遷移率變化以及線粒體融合與分裂基因的變化。方法：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和IL-8作用組。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)方法觀察IL-8作用下細(xì)胞遷移能力的變化；Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移率；ELISA實(shí)驗(yàn)檢測不同遷移率的細(xì)胞內(nèi)源性IL-8的分泌量；Western blot法檢測線粒體外膜蛋白Tom20及線粒體膜間腔蛋白細(xì)胞色素C(cytochrome C， Cyt C)的表達(dá)。RT-PCR檢測線粒體融合基因Mfn1、Mfn2、OPA1及分裂基因Fis1、Drp1、MTP18的表達(dá)；MitoTracker Red CMXRos染色激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中線粒體的形態(tài)。結(jié)果：肺腺癌A549細(xì)胞的遷移率高于SPC-A-1細(xì)胞，且內(nèi)源性IL-8的分泌也高于SPC-A-1細(xì)胞。IL-8作用下A549細(xì)胞的遷移率增加，并存在時(shí)間依賴性。與對(duì)照組比較，IL-8作用組的A549細(xì)胞線粒體膜間腔蛋白Cyt C蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，外膜蛋白Tom20表達(dá)增加(P<0.05)，線粒體外膜融合基因Mfn1及Mfn2表達(dá)增加(P<0.05)，內(nèi)膜融合基因OPA1表達(dá)降低(P<0.05)，分裂基因Fis1無明顯變化(P>0.05)，Drp1及MTP18增加(P<0.05)；激光共聚焦顯微鏡顯示IL-8作用下線粒體形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)點(diǎn)狀聚集。結(jié)論：A549細(xì)胞在IL-8作用下遷移率增加，可能與A549細(xì)胞線粒體融合與分裂基因變化有關(guān)。

肺腺癌； 細(xì)胞遷移； 線粒體； IL-8

研究人員普遍認(rèn)為趨化因子不僅與炎癥和造血過程中促進(jìn)白細(xì)胞的遷移相關(guān)，近年來研究還發(fā)現(xiàn)，其與白細(xì)胞浸潤、腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)[1]。A549細(xì)胞是肺腺癌細(xì)胞中一種增殖快、惡性程度高的低分化細(xì)胞株[2]，易發(fā)生遷移。肺癌細(xì)胞可以通過淋巴道進(jìn)行轉(zhuǎn)移，其中白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)是一種趨化因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移[3]。有研究人員發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞A549的趨化性和侵襲性也可能與線粒體的動(dòng)態(tài)分布及極性相關(guān)[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)探討IL-8對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響以及對(duì)線粒體融合與分裂基因表達(dá)的影響，進(jìn)而明確IL-8促進(jìn)A549細(xì)胞遷移過程中，線粒體內(nèi)、外膜融合與分裂基因的動(dòng)態(tài)改變與細(xì)胞遷移的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人肺腺癌A549細(xì)胞、人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室保存。抗細(xì)胞色素C(cytochrome C, Cyt C)和抗Tom20抗體購于Santa；抗β-actin抗體購于EPITOMICS；重組人IL-8購于PeproTech；II抗購自Proteintech；Transwell小室(8.0 μm)購于Millipore；RMPI-1640 培養(yǎng)基購自Gibco；化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)顯色液(ECL)試劑購于Thermo； ECL顯色系統(tǒng)購自Gene；PCR引物購于上海吉瑪；MitoTracker Red CMXRos購于Invitrogen。SDS、丙烯酰胺、蘇木精及其它試劑均由長春寶信生物技術(shù)有限公司提供。蛋白質(zhì)電泳裝置及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購于Bio-Rad。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)基，pH 7.3)中進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。0.25%胰酶消化傳代，取處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、IL-8作用24 h組、IL-8作用48 h組。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前一晚用直尺和Marker筆在超凈臺(tái)內(nèi)紫外燈下照射過夜。鋪板前用Marker筆在6孔板背面，沿著直尺，每隔0.8 cm劃1 條橫線，橫穿過孔。每孔劃4條線。將A549細(xì)胞制成懸浮液，以每孔5×105的密度接種于6孔板中。待細(xì)胞鋪滿孔板后，用200 μL的移液器槍頭比量直尺，盡量垂直于背后的Marker筆橫線進(jìn)行劃痕。劃痕后，用1 mol/L PBS沖洗細(xì)胞3次。換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)加入IL-8。選取位置并標(biāo)記后進(jìn)行拍照，放入37 ℃、5% CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h、48 h后觀察并在相同位置進(jìn)行拍照并保存圖像。

3.2 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，分別將A549細(xì)胞懸浮液，以每孔5×105的密度接種于6孔板中，細(xì)胞種在上室內(nèi)，下室內(nèi)加入培養(yǎng)液。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)表明A549細(xì)胞在種植4 h后開始貼壁。貼壁后進(jìn)行遷移，遷移時(shí)間為24 h和48 h。24 h和48 h后進(jìn)行蘇木精染色或用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，收集上室內(nèi)細(xì)胞及下室內(nèi)細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3.3 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測不同遷移率的細(xì)胞其內(nèi)源性IL-8的分泌量 收集A549細(xì)胞及SPC-A-1細(xì)胞上清液。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，并進(jìn)行混勻，精確反應(yīng)蒸餾水調(diào)零，檢測450 nm吸光度值。按照說明書進(jìn)行計(jì)算。

3.4 Western blot法檢測Cyt C和Tom20的表達(dá) 加入IL-8作用24 h，刮取細(xì)胞，并800 r/min離心收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS 洗滌3次，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液并提取蛋白，檢測蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，采用Bio-Rad蛋白質(zhì)電泳裝置及轉(zhuǎn)移裝置將蛋白移至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入5% 的脫脂奶粉中進(jìn)行封閉，封閉膜上的非特異結(jié)合位點(diǎn)，2～4 h，PBST洗膜3次，每次10 min，加入Ⅰ抗，4 ℃冰箱中過夜。次日PBST 洗膜3 次，每次10 min，加入Ⅱ 抗，室溫孵育1.5 h，倒掉Ⅱ抗，PBST洗膜3 次，每次10 min，ECL顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色，采集圖像后保存。

3.5 RT-PCR檢測線粒體基因Mfn1、Mfn2、OPA1、Fis1、Drp1和MTP18的表達(dá) 用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA, 采用逆轉(zhuǎn)錄酶、oligo(dT)18和dNTP將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 從中取1 μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照, 引物序列及PCR 產(chǎn)物片段大小見表1。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, Mfn1、OPA1、Drp1和Fis1為35個(gè)循環(huán)，GAPDH 為27個(gè)循環(huán)。

3.6 MitoTracker Red CMXRos激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態(tài) 細(xì)胞置于24孔板里的蓋玻片上培養(yǎng)過夜，IL-8作用24 h后，用MitoTracker Red CMXRos 染料37 ℃孵育30 min。4%的多聚甲醛固定，用Hoechst 33342(1 μg/L，Sigma)染細(xì)胞核2 min，1 mol/L PBS沖洗3次。Olympus FV1000共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)。采集圖像后保存。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

電泳條帶密度值以灰度×面積/參照物的比值表示。各組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.5軟件分析，各實(shí)驗(yàn)組間均值比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。

結(jié) 果

1 A549細(xì)胞和SPC-A-1細(xì)胞的遷移情況和內(nèi)源性IL-8的分泌

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在無IL-8刺激的情況下，A549細(xì)胞的遷移率顯著高于SPC-A-1細(xì)胞 (P<0.05)，但都處于較低水平。ELISA法檢測結(jié)果表明A549細(xì)胞中內(nèi)源性IL-8的分泌量顯著高于SPC-A-1細(xì)胞(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The migration and IL-8 secretion of A549 cells and SPC-A-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsSPC-A-1.

圖1 A549細(xì)胞與SPC-A-1細(xì)胞的遷移情況和內(nèi)源性IL-8的分泌

2 IL-8對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，IL-8(100 μL/mL)處理12 h和48 h后A549細(xì)胞的遷移能力明顯增加。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，IL-8(100 μL/mL)處理12 h和48 h后A549細(xì)胞由劃痕邊緣向中間的遷移距離明顯增加，見圖2、表2。

Figure 2.The effect of IL-8 treatment for different time on the migration of A549 cells (×200).

圖2 A549細(xì)胞經(jīng)IL-8作用不同時(shí)間的遷移情況

表2 A549細(xì)胞經(jīng)IL-8作用不同時(shí)間的遷移情況

Table 2.The effect of IL-8 on the migration of A549 cells at different time points detected by Transwell assay and scratch assay (Mean±SD.n=3)

GroupTransmembranecellnumber(cells/field)Thedistancetothecenterline(mm)Control18.0±1.716.00±1.21IL-8(24h)39.0±8.3*6.20±1.09*IL-8(48h)72.0±14.4*1.40±0.95*

*P<0.05vscontrol.

3 Western blot法檢測IL-8對(duì)A549細(xì)胞Tom20及Cyt C蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，A549細(xì)胞的Tom20蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，IL-8處理組的Cyt C蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖3。

4 RT-PCR法檢測IL-8對(duì)A549細(xì)胞線粒體融合基因Mfn1、Mfn2和OPA1表達(dá)水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，IL-8處理組A549細(xì)胞線粒體外膜融合基因Mfn1和Mfn2水平增加(P<0.05)，線粒體內(nèi)膜融合基因OPA1水平降低(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.The effects of IL-8 on Tom20 and Cyt C protein expression in the A549 cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3 Western blot法檢測IL-8對(duì)A549細(xì)胞線粒體Cyt C及Tom20蛋白表達(dá)的影響

5 RT-PCR法檢測IL-8對(duì)A549細(xì)胞線粒體分裂基因Fis1、MTP18和Drp1表達(dá)水平的檢測

RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較， IL-8處理組A549細(xì)胞線粒體分裂基因的表達(dá)Fis1無顯著變化(P>0.05)，MTP18和Drp1表達(dá)均增加(P<0.05)，見圖5。

6 MitoTracker Red CMXRos激光共聚焦顯微鏡觀察IL-8作用前后A549細(xì)胞線粒體的形態(tài)改變

與對(duì)照組比較，IL-8處理組的A549細(xì)胞的線粒體發(fā)生點(diǎn)狀聚集，見圖6。

討 論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中腦部為肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的部位之一，其發(fā)生率高，約為23%～62%，且后果嚴(yán)重[4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長及血管生成，有助于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，并在肺癌腦轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定作用[5]。此外，炎癥趨化因子、生長因子、神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)因子、癌胚抗原、抑癌基因等因素也成為肺癌腦轉(zhuǎn)移的影響因素[6-7]。IL-8作為炎癥趨化因子，與其相應(yīng)受體CXCR1、CXCR2結(jié)合后，通過G蛋白信號(hào)傳遞鏈引起生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移[3]。研究人員發(fā)現(xiàn)IL-8能夠調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞的黏附能力和侵襲能力[8]。在IL-8誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生遷移的過程中，除自身的能量及代謝的需求外，還需額外為細(xì)胞遷移提供能量。因此，線粒體可能在此過程中發(fā)揮一定的作用。

Figure 4.The effects of IL-8 on the mRNA expression of Mfn1, Mfn2 and OPA1 in the A549 cells determined by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 RT-PCR法檢測IL-8對(duì)A549細(xì)胞線粒體融合基因Mfn1、Mfn2和OPA1表達(dá)的變化

Figure 5.The effects of IL-8 on the mRNA expression of Fis1, Drp1 and MTP18 in the A549 cells determined by RT-PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖5 RT-PCR法檢測IL-8對(duì)A549細(xì)胞線粒體融合基因Fis1、Drp1和MTP18表達(dá)水平的影響

Figure 6.The formation of punctate aggregates in the mitochondria of the A549 cells treated with IL-8 observed under confocal microscope (×1 200).

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察A549細(xì)胞線粒體的形態(tài)變化

線粒體的結(jié)構(gòu)主要包含線粒體外膜、線粒體膜間腔、線粒體內(nèi)膜和線粒體基質(zhì)4個(gè)部分[9]。其中，線粒體外膜主要參與一些生化反應(yīng)，如脂肪酸鏈的延伸；同時(shí)也能對(duì)那些將在線粒體基質(zhì)中進(jìn)行徹底氧化的物質(zhì)進(jìn)行初步分解。線粒體膜間腔作為線粒體外膜與內(nèi)膜的中間結(jié)構(gòu)，含有相關(guān)的可溶性酶類及底物。線粒體的內(nèi)膜包裹線粒體基質(zhì)，內(nèi)膜蛋白質(zhì)含量明顯高于線粒體外膜的蛋白質(zhì)含量，因此也負(fù)擔(dān)更多的生化反應(yīng)，參與ATP的合成，也能調(diào)控線粒體的融合與分裂。線粒體的基質(zhì)中含有多種物質(zhì)，包括線粒體DNA、RNA及核糖體。Tom20為線粒體外周蛋白Tom復(fù)合物外周亞基中的一種。Tom20能夠識(shí)別蛋白前序列和非折疊的成熟前蛋白，以及成熟蛋白或體積較大的疏水性前體蛋白，并且其功能區(qū)還有分子伴侶的活性，能夠維持底物前蛋白的非折疊狀態(tài)，防止在線粒體聚集[10]。線粒體外膜蛋白Tom20的增加可能與線粒體外膜形成相關(guān)。此外線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的供能中心能夠通過線粒體信號(hào)，如細(xì)胞色素C 信號(hào)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[11]。Cyt C存在于膜間腔線粒體內(nèi)膜外側(cè)，與線粒體呼吸鏈的傳遞及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Cyt C的釋放能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們的結(jié)果顯示，在IL-8作用下，細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)量明顯降低，結(jié)果表明，細(xì)胞色素C釋放降低時(shí)，可能會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。

研究證明，線粒體融合與分裂之間的動(dòng)態(tài)平衡是維持線粒體生理功能及形態(tài)的重要影響因素。線粒體在融合前，Mfn1 和Mfn2 形成寡聚體綁定在線粒體外膜上[12]。線粒體的融合是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括線粒體在胞質(zhì)中運(yùn)動(dòng)、線粒體膜的改變、外膜的融合、內(nèi)膜的對(duì)接和融合、線粒體DNA 和基質(zhì)的混合[12]。Mfn1/2 是調(diào)控線粒體融合的主要分子，在線粒體融合過程中發(fā)揮重要作用，而且Mfn1 與Mfn2 可能在線粒體融合的不同階段起作用。Mfn1 主要在融合的前期促進(jìn)線粒體間的彼此結(jié)合，Mfn2 主要在線粒體融合反應(yīng)的后期起作用，如促進(jìn)線粒體融合，有利于內(nèi)膜對(duì)接等。線粒體的內(nèi)膜融合是由OPA1介導(dǎo)的，OPA1定位于線粒體膜間腔，它的缺失與線粒體自噬及線粒體片段化的形成有關(guān)[13-15]。

線粒體分裂有時(shí)會(huì)形成膜電勢(shì)不均一的子代線粒體，其中一個(gè)子代線粒體的膜電勢(shì)增高，而另一個(gè)子代線粒體的膜電勢(shì)會(huì)減低。膜電勢(shì)增高的子代線粒體容易與其它線粒體融合，而膜電勢(shì)低的線粒體難于融合，并且線粒體上介導(dǎo)線粒體融合的分子OPA1 的水平降低，最終會(huì)被自噬性吞噬[13]，從而使線粒體維持融合和分裂的穩(wěn)態(tài)[15]。Drp1與Fis1參與并調(diào)控線粒體的分裂。Fis1 定位在線粒體上，將Drp1 募集到線粒體上形成指環(huán)狀結(jié)構(gòu)，將線粒體擠壓斷裂[14-16]，從而發(fā)揮使線粒體分裂的作用。MTP18是一種18 kD 的蛋白質(zhì)，定位于線粒體的膜間隙，是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號(hào)傳遞的下游執(zhí)行分子，可能起到將Drp1募集到線粒體外膜的作用[17]。過表達(dá)Fis1會(huì)誘導(dǎo)線粒體的斷裂并引發(fā)自噬，而過表達(dá)OPA1、敲減Fis1則抑制線粒體自噬的發(fā)生[14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，線粒體外膜融合基因Mfn1與線粒體外膜蛋白Tom20表達(dá)的趨勢(shì)一致，IL-8能夠促進(jìn)A549細(xì)胞的線粒體外膜融合基因Mfn1和Mfn2的表達(dá)，增加線粒體外膜蛋白的表達(dá)，但降低線粒體內(nèi)膜融合基因OPA1的表達(dá)。OPA1的水平降低可能是發(fā)生了線粒體自噬，線粒體自噬在一定程度上有利于線粒體維持其正常功能。而線粒體分裂相關(guān)基因Drp1和MTP18的表達(dá)略增加。線粒體形態(tài)發(fā)生改變，點(diǎn)狀聚集增加。以上結(jié)果表明，IL-8能夠促進(jìn)A549細(xì)胞線粒體外膜融合增加、內(nèi)膜的融合降低，并可能伴隨線粒體自噬這種線粒體的動(dòng)態(tài)改變，可能是IL-8促進(jìn)A549細(xì)胞遷移的機(jī)制之一。而線粒體結(jié)構(gòu)的具體變化以及功能的異常與腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲之間的關(guān)系還需深入研究。

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Effect of IL-8 on mitochondrial fusion and fission gene expression in human lung adenocarcinoma cell line A549 during cell migration

ZHANG Yu1, GAO Yu-fei2, SU Jing1, YU Chun-yan3, HE Yi-chun2, SUN Lian-kun1

(1DepartmentofPathophysiology,CollegeofBasicMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China;2TheFirstDepartmentofNeurosurgery,TheThirdNormanBethuneHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China;3DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,BeihuaUniversity,Jinlin132013,China.E-mail:Sunlk@jlu.edu.cn)

AIM: To investigate the changes of migration of lung adenocarcinoma cells promoted by IL-8 and the inner and outer mitochondrial membrane dynamic changes during this process. METHODS: Human lung adenocarcinoma cell line A549 was divided into control group and IL-8 group. Cell migration was analyzed by scratch detection and Transwell assay. The secretion of endogenous IL-8 was detected by ELISA. The protein levels of mitochondrial cytochrome C (Cyt C) and mitochondrial outer membrane protein Tom20 was detected by Western blot. The mRNA expression of mitochondrial fusion genesMfn1,Mfn2andOPA1 and fission genesFis1,Drp1andMTP18 was detected by RT-PCR. The morphological changes of mitochondria were observed by MitoTracker Red CMXRos dye staining and confocal microscopy. RESULTS: The migratory rate of A549 cells and endogenous secretion of IL-8 in A549 cells were higher than those in SPC-A-1 cells. The migratory rate of A549 cells was improved by IL-8 in a time-dependent manner. Compared with control group, the Tom20 protein expression was increased (P<0.05), and the Cyt C protein expression was decreased (P<0.05). The expression of mitochondrial outer membrane fusion genesMfn1 andMfn2 was increased (P<0.05), and the expression of mitochondrial inner membrane fusion geneOPA1 was decreased (P<0.05). The expression of fission genesDrp1 andMTP18 were decreased (P<0.05), while the expression ofFis1 was no change (P>0.05). Under confocal microscope, the punctate aggregates in the mitochondria of the A549 cells treated with IL-8 were observed. CONCLUSION: The migratory rate of A549 cells is increased by IL-8, which is related to the changes of mitochondrial fusion genes and the fission genes.

Lung adenocarcinoma; Cell migration; Mitochondria; IL-8

1000- 4718(2015)04- 0597- 06

2014- 10- 14

2015- 02- 04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81272876;No.81372696)；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2013M541314)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No.2009-36)

R730.23; R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.004

△通訊作者 Tel: 0431-85613485; E-mail: sunlk@jlu.edu.cn