miR-26a-5p調控MCL-1在孕產婦子癇前期中表達的臨床意義*

楊 瑩， 茍文麗， 谷 寅， 程 黎， 賴彩琴， 鞠葉蘭， 王晨虹△

(1廣州醫科大學深圳市婦幼保健院，廣東 深圳 518000； 2西安交通大學醫學院第一附屬醫院，陜西 西安 710000)

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miR-26a-5p調控MCL-1在孕產婦子癇前期中表達的臨床意義*

楊 瑩1， 茍文麗2， 谷 寅1， 程 黎1， 賴彩琴1， 鞠葉蘭1， 王晨虹1△

(1廣州醫科大學深圳市婦幼保健院，廣東 深圳 518000；2西安交通大學醫學院第一附屬醫院，陜西 西安 710000)

目的： 探討microRNA-26a-5p(miR-26a-5p)調控髓細胞白血病因子1(myeloid cell leukemia -1，MCL-1)表達在孕產婦子癇前期發生發展中的臨床意義。方法: 收集正常妊娠21例、妊娠期高血壓孕產婦13例、輕度子癇前期15例和重度子癇前期26例共4組孕產婦血漿及胎盤組織，用real-time PCR分析其血漿及胎盤組織中miR-26a-5p及胎盤組織中MCL-1 mRNA的表達，Western blotting分析胎盤組織中MCL-1蛋白的表達，并分析其表達的臨床意義。結果: 隨著病情進展，miR-26a-5p在孕產婦血漿和胎盤中表達逐步增高(P<0.01)，而其胎盤組織中MCL-1 mRNA的表達明顯降低(P<0.01)，二者呈明顯負相關(P<0.01)；胎盤組織中miR-26a-5p與MCL-1蛋白表達呈明顯負相關(P<0.01)。孕產婦血漿及胎盤組織中miR-26a-5p表達上調與孕齡、孕婦血漿白蛋白水平及胎兒體重呈明顯負相關，而與孕產婦血壓和尿蛋白水平呈明顯正相關(P<0.01)，胎盤組織中MCL-1表達下調與此相反。結論: miR-26a-5p高表達通過下調MCL-1的表達參與子癇前期的發生與發展。

子癇前期; 微小RNA-26a-5p; 髓細胞白血病因子1

子癇前期(preeclampsia, PE)于妊娠20周后出現，以新發高血壓和蛋白尿為特征，并導致全身多系統損害，是導致孕產婦及新生兒死亡的主要原因之一。在全世界范圍內，PE發病率大約為5～8%[1]，發病機制至今未明。但可以確定的是，胎盤功能異常在子癇前期的發生與發展中起重要作用[2]。研究發現，子癇前期孕產婦胎盤組織中存在特異性表達的microRNA，與胎盤組織細胞的凋亡和轉錄調控有關，相關microRNA在血液中表達穩定，易于檢測[3-5]。Mayor等[6]比較了子癇前期與正常妊娠胎盤組織中差異表達的microRNA與其差異表達的靶基因，結果顯示microRNA及其靶基因表達的變化均參與了子癇前期的發生。研究顯示miR-26a在重度子癇前期孕婦胎盤及血清中表達明顯上調[7-8]，提示其可能參與了子癇前期的發生發展，而髓細胞白血病因子1(myeloid cell leukemia-1,MCL-1)可能是miR-26a所調控的靶基因[9-10]。然而，miR-26a與其靶基因在子癇前期發生發展中的作用機制研究報道甚少。本研究擬通過分析子癇前期孕產婦血清和胎盤中miR-26a-5p與其靶基因MCL-1的表達及相關性，為探索其在子癇前期發生發展中的作用提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 患者資料、病理標本收集

收集深圳市婦幼保健院入院分娩的正常(normal)孕產婦21例，平均年齡(31.8±4.4)歲；妊娠期高血壓(gestational hypertention，GH)孕產婦13例，平均年齡(30.4±3.6)歲;輕度子癇前期(mild preeclampsia，MPE)孕產婦15例，平均年齡(31.7±4.2)歲;重度子癇前期(severe preeclampsia，SPE)患者26例，平均年齡(30.8±4.0)歲。GH、MPE和SPE定義參考《婦產科學》第8版教材[11]。孕產婦患有原發性高血壓病、心臟疾患、慢性腎臟病、肝炎、糖尿病、妊娠期感染性疾病或其它妊娠期并發癥等不納入本試驗。留取入院時孕產婦血漿2 mL和分娩時胎盤組織30～50 g以備檢測。統計其入院時孕婦年齡、孕齡、血壓、24 h尿蛋白(正常組除外)、孕產次、血肌酐、白蛋白、血小板數量、孕婦體重、孕婦水腫狀態、胎兒娩出時體重、多胎妊娠與否、胎兒性別等，分析各組上述指標的差異(表 1)，并統計血清及胎盤組織中miR-26a-5p和MCL-1表達的相關性及與各臨床指標的關系。

表1 4組孕產婦臨床病理特征及分析

2 MicroRNA及mRNA提取及real-time PCR檢測

血漿和胎盤組織總RNA提取采用TRIzol法(Invitrogen)，參考試劑說明書進行操作。取1 μg總RNA，逆轉錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(mRNA, Thermo Scientific)、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H)(microRNA, TaKaRa)合成cDNA，-20 ℃冰箱保存備用。miR-26a-5p的上游引物為5’-ATGGTTCGTGGGTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3’, 下游引物為5’-GCAGGGTCCGAGGTATTCG-3’；內參照U6的上游引物為:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；MCL-1的上游引物為5’-GCATCAGGAATGTGCTGCTGG-3’，下游引物為5’-GGTGGTGGTGGTGGTTGGTT-3’；內參照人18S rRNA 的上游引物為5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物為5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。用ABI-ViiA 7 Detection System熒光定量PCR儀行定量分析，對miR-26a-5p循環參數設為95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 34 s，共44個循環。對MCL-1循環參數為95 ℃ 30 s；95℃ 3 s，60 ℃ 34 s，共45個循環。以7500 Software 2.0.6進行擴增和熔解曲線分析。MCL-1及miR-26a-5p相對表達量分析參考文獻使用2-ΔΔCt法計算[12]。

3 Western blotting 檢測

MCL-1兔抗人多克隆抗體及兔抗人GAPDH抗體購自Cell Signaling。正常妊娠、妊娠高血壓、輕度子癇前期、重度子癇前期孕產婦胎盤組織總蛋白提取參考KeyGene蛋白提取試劑盒說明書進行。12%的SDS-PAGE分離蛋白，并轉印至PVDF膜(Millipore)。5%的脫脂牛奶封閉后，用兔抗- MCL-1抗體(1∶200)和兔抗-GAPDH抗體(1∶1 000)4 °C冰箱孵育過夜，次日用含0.1% 吐溫-20的PBS(PBST)室溫洗膜3～5次，每次5～10 min，然后用HRP交聯的鼠抗兔II抗(1∶3 000)室溫孵育1 h。再次以PBST洗膜3次后以ECL發光顯色液顯色，膠片夾內曝光顯影，清洗膠片保存以備分析。

4 統計學處理

以SPSS 16.0軟件進行數據統計分析，miR-26a-5p、MCL-1的表達及臨床資料在不同組間比較采用單因素方差分析,率的比較采用卡方檢驗，兩組間相關性比較采用Spearman秩相關分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 孕產婦血漿及胎盤中miR-26a-5p的表達變化及胎盤組織中MCL-1的表達

妊娠期高血壓、輕度子癇前期和重度子癇前期是妊娠期高血壓疾病病情進展的不同階段。通過比較SPE、MPE及GH孕產婦及正常孕產婦血漿及胎盤組織中miR-26a-5p表達變化發現，在SPE孕產婦血漿及胎盤組織中miR-26a-5p表達較MPE、GH及正常組明顯升高，且隨著病情進展，miR-26a-5p表達無論在血漿或胎盤中表達均呈明顯上升趨勢。而MCL-1 mRNA表達在SPE孕產婦胎盤組織中表達較MPE、GH及正常組明顯下降，提示隨著病情加重，胎盤組織中MCL-1 mRNA表達明顯下降，見圖1。

Figure 1.The miR-26a-5p expression in plasma/placentas and mRNA expression of MCL-1 in placentas of normal, GH, MPE and SPE pregnant women.

圖1 miR-26a-5p在正常、妊娠高血壓疾病、輕度子癇、重度子癇前期孕產婦血漿及胎盤組織中表達及MCL-1 mRNA在4組孕產婦胎盤組織中的表達

2 血漿及胎盤組織中miR-26a-5p表達變化及其與胎盤組織中MCL-1 mRNA表達變化的相關性分析

通過對比正常妊娠、GH、MPE和SPE 4組孕產婦血漿及胎盤組織中miR-26a-5p表達變化與胎盤組織中MCL-1 mRNA表達變化的相關性，結果發現，隨著miR-26a-5p表達的增加，MCL-1 mRNA表達呈明顯下降趨勢，血漿中miR-26a-5p與胎盤組織中MCL-1 mRNA、胎盤組織中miR-26a-5p與MCL-1 mRNA表達呈明顯負相關(P<0.01)，提示隨著血漿或胎盤組織中miR-26a-5p表達的增加，胎盤組織中MCL-1 mRNA的表達逐漸下降，表明在妊娠高血壓疾病中，miR-26a-5p至少部分是通過影響MCL-1基因表達進而在妊娠高血壓疾病的發生發展中起作用。而分析血漿及胎盤組織中miR-26a-5p表達變化結果顯示兩者呈明顯正相關(P<0.01)，提示檢測血漿中miR-26a-5p表達的變化可以很好反映胎盤組織中miR-26a-5p表達量，見圖2。

Figure 2.The correlation analysis between miR-26a-5p expression in plasma/placentas and MCL-1 mRNA expression in placentas, and the correlation analysis of miR-26a-5p expression between plasma and placentas.

圖2 血漿及胎盤組織中miR-26a-5p與胎盤組織中MCL-1 mRNA表達的相關性，以及血漿與胎盤組織中miR-26a-5p表達的相關性分析

3 胎盤組織中miR-26a-5p、MCL-1 mRNA和蛋白表達及其相關性

各組隨機選擇5例患者進行血漿miR-26a-5p、胎盤組織miR-26a-5p、MCL-1 mRNA及蛋白表達量分析，結果發現，在normal、GH、MPE和SPE組，MCL-1蛋白表達呈明顯下降趨勢，提示隨著病情進展，MCL-1蛋白表達明顯下調；胎盤組織中miR-26a-5p表達與胎盤組織中MCL-1蛋白表達呈明顯負相關，而MCL-1的mRNA和蛋白表達呈正相關。這表明miR-26a-5p通過抑制胎盤組織中MCL-1 的mRNA生成來抑制MCL-1蛋白的產生，并非誘導MCL-1 mRNA轉錄后翻譯的抑制，進而促進了子癇前期的發生發展，見圖3

4 血漿及胎盤組織中miR-26a-5p及胎盤組織中MCL-1的mRNA表達與其臨床特征的相關性分析

我們分析了miR-26a-5p及MCL-1的mRNA表達變化與GH、MPE、SPE孕產婦孕齡、血壓、尿蛋白量、白蛋白量及胎兒體重的相關性，結果顯示，血漿及胎盤組織中miR-26a-5p的表達上調與孕產婦孕齡、白蛋白水平及胎兒體重呈明顯負相關(P<0.01)。而孕產婦胎盤及血漿中miR-26a-5p表達變化與孕產婦收縮壓、舒張壓及尿蛋白水平呈明顯正相關(P<0.01)；在胎盤組織中，MCL-1 mRNA的表達下調與此相反，見表2。

討 論

妊娠高血壓疾病包括妊娠期高血壓、子癇前期和子癇，其發病機制復雜，具體機制仍不清楚。近年來研究發現，PE胎盤組織與正常胎盤組織相比，存在一些特異性、差異表達的microRNA，提示microRNA表達的變化參與了子癇前期的發生與發展，豐富了我們對子癇前期發病機制的認識。我們通過比較正常妊娠、GH、MPE和SPE孕產婦血漿及胎盤組織中miR-26a-5p及其靶基因MCL-1表達的變化，表明隨著病情進展，miR-26a-5p表達呈明顯升高趨勢，而MCL-1 mRNA及蛋白表達呈明顯下降趨勢，二者存在明顯負相關。這提示miR-26a-5p可能通過調控胎盤組織中MCL-1基因的表達參與了子癇前期發生與發展的進程。

Choi等[8]比對正常和子癇前期孕產婦胎盤組織中microRNA表達時發現，miR-26a在SPE孕產婦胎盤組織中表達較正常平均升高2.75倍，表明其可能參與了子癇前期的發生發展。成熟的miR-26a包括其miR-26a-5p和miR-26a-3p成熟片段，我們研究發現，在GH、MPE和SPE孕產婦血漿和胎盤組織中，miR-26a-5p表達呈明顯上升趨勢，尤以SPE胎盤和血漿中表達升高明顯，與Choi等[8]研究結果一致。我們比較了4組孕產婦胎盤組織和血漿中miR-26a-5p表達的相關性，結果顯示二者呈明顯正相關，提示血漿中microRNA表達可以很好地顯示胎盤組織中相關microRNA表達的變化，同時也表明胎盤組織中microRNAs參與了妊娠期高血壓疾病的全身性改變。那么，miR-26a-5p 調控哪些靶基因參與了子癇前期的發生和發展呢？Yang等[9]研究肝癌中miR-26a功能時發現，miR-26a在肝癌中表達下降，作為抑癌基因起作用，上調miR-26a能夠明顯抑制MCL-1基因表達。此外，miR-26a通過抑制MCL-1基因表達進而抑制乳腺癌細胞增殖和轉移[10]。而MCL-1基因表達下調還與腫瘤細胞的凋亡有關[13]。而在妊娠高血壓疾病中，隨著病情進展，miR-26a-5p表達明顯升高，與腫瘤性疾病表達相反。是否miR-26a表達上調夠通過抑制MCL-1在妊娠高血壓疾病中也發揮重要作用呢？我們發現，在妊娠高血壓疾病孕產婦血漿及胎盤組織中，miR-26a-5p表達逐步升高，而胎盤MCL-1 mRNA及蛋白表達呈下降趨勢，二者呈明顯負相關，這就表明，miR-26a-5p高表達可能通過抑制MCL-1基因表達參與了妊娠高血壓疾病的發生與發展。研究發現，MCL-1存在MCL-1S和MCL-1L可變剪切體，在子癇前期孕產婦胎盤組織中，依賴caspase-3/7凋亡蛋白酶剪切形成死亡抑制因子MCL-1S，并向死亡促進因子MCL-1S轉變[14]。此外，低氧-復氧誘導胎盤絨毛膜細胞MCL-1L可變剪切體形成，能夠阻斷其凋亡。由于生理性低氧在胎盤滋養層細胞分化中發揮重要作用，而這種低氧可誘導抑制細胞死亡MCL-1L剪切體的形成，表明MCL-1在胎盤功能中發揮重要作用。Kalkat等[15]研究發現，MCL-1通過與BECN1蛋白相互作用抑制人胎盤滋養層細胞自噬的發生，過表達MCL-1能夠減弱氧化應激所致自噬增加效應，由于自噬在胎盤生理性低氧過程中維持滋養層細胞生長發育、分化以及營養供給中起重要作用[16]，因此，MCL-1表達的變化勢必引起胎盤功能障礙，誘發胎盤相關性疾病的發生。

Figure 3.The protein expression MCL-1 in normal, GH, MPE and SPE pregnant women and its correlations with the expression of miR-26a-5p and MCL-1 mRNA.

圖3 正常妊娠、妊娠期高血壓、輕度子癇前期和重度子癇前期孕產婦胎盤組織中MCL-1蛋白表達及其與MCL-1 mRNA和miR-26a-5p表達的相關性分析

表2 血漿和胎盤組織中miR-26a-5p和胎盤組織中MCL-1 mRNA的表達變化與孕產婦臨床特征的關系

此外，我們研究發現，miR-26a-5p高表達與育齡、孕產婦血清白蛋白、胎兒體重呈明顯負相關，與孕產婦血壓和蛋白尿呈明顯正相關。研究發現，miR-26a在調控血管平滑肌細胞功能諸如細胞增殖、凋亡和表型轉換中發揮關鍵作用[17]，這就支持我們的結論，表明miR-26a-5p可能通過調控胎盤血管平滑肌細胞的功能，在子癇前期的發病中起作用。動物實驗發現，mmu-miR-26a等足突細胞特異性microRNA功能缺失導致小鼠出生2周后發生顯著蛋白尿，在出生后3周發生顯著腎小球和腎小管損傷[18]。表明miR-26a表達變化參與了腎小球足突細胞重要的功能，在腎小球濾過屏障中發揮重要作用。我們研究顯示，miR-26a-5p表達在子癇前期孕產婦胎盤和血漿中表達明顯升高，而與孕產婦蛋白尿表達呈明顯正相關，表明miR-26a-5p可能參與調控子癇前期孕產婦腎小球濾過膜的功能，進而導致蛋白尿增多，但需要進一步驗證。

總之，在妊娠高血壓疾病中，隨著病情進展，miR-26a-5p表達明顯增加，而胎盤組織中MCL-1 mRNA及蛋白表達明顯下降，兩者呈明顯負相關。miR-26a-5p及MCL-1這一組合變化與孕產婦血壓、低蛋白血癥、蛋白尿等呈明顯相關性，表明miR-26a-5p和MCL-1相互作用參與了妊娠高血壓疾病的發生發展。

[1] Kanasaki K, Kalluri R. The biology of preeclampsia[J]. Kidney Int, 2009, 76(8):831-837.

[2] Enquobahrie DA, Abetew DF, Sorensen TK, et al. Placental microRNA expression in pregnancies complicated by preeclampsia[J]. Am J Obstet Gynecol, 2011, 204(2):178.e12-178.e21.

[3] Pineles BL, Romero R, Montenegro D, et al. Distinct subsets of microRNAs are expressed differentially in the human placentas of patients with preeclampsia[J]. Am J Obstet Gynecol, 2007, 196(3):261.e1-261.e6.

[4] Hu Y, Li P, Hao S, et al. Differential expression of microRNAs in the placentae of Chinese patients with severe pre-eclampsia[J]. Clin Chem Lab Med, 2009, 47(8): 923-929.

[5] Hromadnikova I, Kotlabová K, Jirásek JE, et al. Detection of placenta-specific microRNAs in maternal circulation[J]. Ceska Gynekol, 2010, 75(3): 252-256.

[6] Mayor-Lynn K, Toloubeydokhti T, Cruz AC, et al. Expression profile of microRNAs and mRNAs in human placentas from pregnancies complicated by preeclampsia and preterm labor[J]. Reprod Sci, 2011, 18(1):46-56.

[7] Wu L, Zhou H, Lin H, et al. Circulating microRNAs are elevated in plasma from severe preeclamptic pregnancies[J]. Reproduction, 2012, 143(3):389-397.

[8] Choi SY, Yun J, Lee OJ, et al. MicroRNA expression profiles in placenta with severe preeclampsia using a PNA-based microarray[J]. Placenta, 2013, 34(9): 799-804.

[9] Yang X, Liang L, Zhang XF, et al. MicroRNA-26a suppresses tumor growth and metastasis of human hepatocellular carcinoma by targeting interleukin-6-Stat3 pathway[J]. Hepatology, 2013, 58(1):158-170.

[10]Gao J, Li L, Wu M, et al. MiR-26a inhibits proliferation and migration of breast cancer through repression of MCL-1[J]. PLoS One, 2013, 8(6):e65138.

[11]茍文麗，楊慧霞. 妊娠期高血壓疾病[M]// 謝 幸，茍文麗，林仲秋.婦產科學. 第8版. 北京：人民衛生出版社，2013:64-72.

[12]Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[13]朱惠明，李銀鵬，候曉華，等. 凋亡素誘導肝癌細胞HepG2凋亡過程中Mcl-1 mRNA和蛋白水平的變化及其意義[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(12):2353-2356.

[14]Soleymanlou N, Jurisicova A, Wu Y, et al. Hypoxic switch in mitochondrial myeloid cell leukemia factor-1/Mtd apoptotic rheostat contributes to human trophoblast cell death in preeclampsia[J]. Am J Pathol, 2007, 171(2):496-506.

[15]Kalkat M, Garcia J, Ebrahimi J, et al. Placental auto-phagy regulation by the BOK-MCL1 rheostat[J]. Auto-phagy, 2013, 9(12):2140-2153.

[16]Gong JS, Kim GJ. The role of autophagy in the placenta as a regulator of cell death[J]. Clin Exp Reprod Med, 2014, 41(3):97-107.

[17]Bai Y, Wang L, Sun L, et al. Circulating microRNA-26a: potential predictors and therapeutic targets for non-hypertensive intracerebral hemorrhage[J]. Med Hypotheses, 2011, 77(4):488-490.

[18]Ho J, Ng KH, Rosen S, et al. Podocyte-specific loss of functional microRNAs leads to rapid glomerular and tubular injury[J]. J Am Soc Nephrol, 2008, 19(11):2069-2075.

Clinical significance of miR-26a-5p-regulated MCL-1 expression in preeclampsia

YANG ying1, GOU Wen-li2, GU Yin1, CHENG Li1, LAI Cai-qin1, JU Ye-Lan1, WANG Chen-hong1

(1ShenzhenMaternalandChildHealthHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Shenzhen518000,China;2TheFirstAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter,Xi’an710000,China.E-mail:szwangchenhong@vip.163.com)

AIM: To investigate the clinical significance of microRNA-26a-5p (miR-26a-5p)-regulated myeloid cell leukemia-1 (MCL-1) expression in the development of maternal preeclampsia. METHODS: Plasma and placental tissues were collected from 21 cases of normal pregnancy, 13 cases of maternal gestational hypertension, 15 cases of mild preeclampsia and 26 cases of severe preeclampsia. The levels of plasma and placental miR-26a-5p and placental MCL-1 mRNA were detected by real-time PCR. Western blotting analysis was used to determine the protein expression of placental MCL-1. The clinical significance of the above parameters was also analyzed. RESULTS: miR-26a-5p expression gradually increased(P<0.01) in the 4 groups of maternal plasma and placentas with the disease development, and the mRNA expression of MCL-1 was significantly reduced in the placentas (P<0.01), both showing a significant negative correlation (P<0.01). Meanwhile, the expression of miR-26a-5p and MCL-1 protein in the placental tissues was negatively correlated (P<0.01). The miR-26a-5p up-regulation in maternal plasma and placental tissues was negatively correlated with gestational age, maternal plasma albumin levels and fetal weight, while it was positively correlated with maternal blood pressure and urinary protein level (P<0.01), which was in contrary to the down-regulation of placental MCL-1. CONCLUSION: Up-regulation of miR-26a-5p is involved in the occurrence and development of preeclampsia by down-regulation of MCL-1.

Preeclampsia; MicroRNA-26a-5p; Myeloid cell leukemia-1

1000- 4718(2015)04- 0713- 06

2014- 11- 05

2014- 12- 30

深圳市科技研發資金項目(No. JCYJ20120821095458279)

R714.24+5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.025

△通訊作者 Tel: 0755-82889999； E-mail: szwangchenhong@vip.163.com