電燒傷大鼠血清誘導單核細胞分泌VEGF對單核-內皮細胞黏附作用的影響*

阮瓊芳， 趙超莉， 葉子青， 謝瓊慧， 謝衛國

(武漢大學同仁醫院暨武漢市第三醫院燒傷研究所，湖北 武漢 430060)

?

電燒傷大鼠血清誘導單核細胞分泌VEGF對單核-內皮細胞黏附作用的影響*

阮瓊芳， 趙超莉， 葉子青， 謝瓊慧， 謝衛國△

(武漢大學同仁醫院暨武漢市第三醫院燒傷研究所，湖北 武漢 430060)

目的： 觀察電燒傷大鼠血清誘導的單核細胞分泌血管內皮生長因子(VEGF)的水平，探討其對單核細胞與血管內皮細胞黏附作用的影響。方法: 制做電燒傷大鼠模型，制備電燒傷大鼠血清，同時制備正常大鼠血清作為對照。采用夾心ELISA法檢測正常大鼠血清和電燒傷大鼠血清中VEGF及其可溶性受體sFlt-1含量。按照隨機數字表法將人單核細胞株THP-1細胞分為正常血清組和電燒傷血清組，ELISA法檢測2組細胞上清液中VEGF和sFlt-1含量。按照隨機數字表法將人單核細胞株THP-1細胞分為正常血清組、燒傷血清組、正常血清+阻斷劑組和燒傷血清+阻斷劑組。取培養3 h、6 h的THP-1細胞，加入單層血管內皮細胞株EA.hy926細胞，行單核-內皮細胞黏附檢測。結果: 大鼠電燒傷后血清VEGF水平較正常大鼠顯著增加， sFlt-1水平較正常大鼠明顯減少。電燒傷血清誘導THP-1細胞分泌VEGF，sFlt-1水平隨之減少。電燒傷血清可促進單核細胞與內皮細胞的黏附作用，sFlt-1可抑制電燒傷血清誘導的單核細胞與內皮細胞的黏附作用。結論: 電燒傷大鼠血清誘導單核細胞分泌VEGF,從而促進單核-內皮細胞黏附。阻斷VEGF的生物學效應，可有效抑制單核-內皮細胞的黏附。

電燒傷； 單核細胞； 內皮細胞； 黏附作用

過度炎癥反應是電燒傷重要的病理生理學改變之一，它是導致和加劇傷后組織進行性壞死的重要原因。單核-內皮細胞黏附是血管炎癥反應的始動環節，因此，闡明單核-內皮細胞黏附作用的機制對電燒傷早期過度炎癥反應的控制具有重要意義。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)又稱血管通透因子(vascular permeabi-lity factor，VPF)，是目前發現的最強的增強血管通透性的物質之一。我們前期研究發現電燒傷早期大量炎癥細胞包括單核細胞、巨噬細胞等均高表達VEGF[1]，我們推測VEGF在電燒傷早期血管炎癥反應中發揮重要作用。本研究擬采用電燒傷大鼠血清培養人單核細胞株THP-1細胞，初步探討單核細胞分泌VEGF對單核-內皮細胞黏附作用的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 材料與試劑 DMEM培養液、RPMI- 1640培養液和FBS購自Gibco；大鼠VEGF、大鼠VEGF可溶性受體sFlt-1、人VEGF和人sFlt-1檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；鈣黃綠素乙酰甲酯(calcein-AM)購自Sigma；sFlt-1購自R&D。

1.2 細胞 人單核細胞株THP-1細胞購自武漢大學細胞保藏中心，人血管內皮細胞株EA.hy926細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.3 動物 清潔級SD大鼠，雌雄各半，體質量180～220 g，由武漢大學動物實驗中心提供，實驗前12 h 禁食，自由飲水。

2 方法

2.1 血清制備 參照文獻[2]方法制作電燒傷模型。電燒傷組大鼠以30 g/L戊巴比妥鈉按10 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于實驗臺上，在大鼠臀部及右后肢備皮，小電極置于右踝上0.5 cm小腿腹側皮膚上，大電極置于同側臀肌處。致傷電壓1 kV，電擊時間0.1 s，創面面積為0.5 cm×0.5 cm、深達骨骼，無低血容量性休克發生。于電燒傷后1 d處死，取外周靜脈血靜置 1 h，1 000×g離心10 min，分離血清，即為電燒傷大鼠血清。正常大鼠不作處理，直接取外周靜脈血，余處理同前，即為正常大鼠血清。電燒傷血清和大鼠血清均于56 ℃滅活30 min，-80 ℃凍存備用。

2.2 細胞培養及實驗分組 將THP-1細胞置于含體積分數10% FBS的RPMI-1640 培養液中，在37 ℃、體積分數5% 的CO2培養箱中培養。取部分THP-1細胞，PBS清洗2次，按照隨機數字表法分為正常血清組：將細胞重懸于含體積分數20%正常大鼠血清的RPMI-1640培養液中；電燒傷血清組：將細胞重懸于含體積分數20%電燒傷大鼠血清的RPMI-1640培養液中；細胞濃度均調至1×109/L。加入6孔板中，每組設6個復孔，每孔2 mL，常規條件培養。

2.3 ELISA檢測大鼠血清和THP-1細胞培養上清中VEGF和sFlt-1的含量 采用雙抗夾心ELISA法測定大鼠血清和THP-1細胞培養上清中VEGF和sFlt-1的含量，操作按說明書進行。采用酶標儀在波長450 nm下測定吸光度值，繪制標準曲線計算含量。

2.4 sFlt-1抑制VEGF生物學活性對單核-內皮細胞黏附作用影響的實驗分組及處理 另取部分THP-1細胞，PBS清洗2次，按照隨機數字表法分為(1)正常血清組：采用含體積分數20%正常大鼠血清的RPMI-1640培養液培養；(2)電燒傷血清組：采用含體積分數20%電燒傷大鼠血清的RPMI-1640培養液培養；(3)正常血清+阻斷劑組：用含100 μg/L sFlt-1和20%正常大鼠血清的RPMI- 1640培養液培養；(4)電燒傷血清+阻斷劑組：用含100 μg/L sFlt-1和20%電燒傷大鼠血清的RPMI-1640培養液培養。調整細胞濃度至1×109/L，加入6孔板中，每組設6個復孔，每孔2 mL，置于常規條件培養。

2.5 單核-內皮細胞黏附檢測 將EA.hy926細胞置于含體積分數10%FBS的DMEM培養液中，在37 ℃、體積分數5%的CO2培養箱中培養，隔天換液，細胞生長達90%融合時用2.5 g/L胰蛋白酶進行消化傳代，擴增細胞用于后續實驗。

采用DMEM培養液將EA.hy926細胞濃度調至1×108/L，加入96孔板，每孔0.2 mL，待細胞完全融合至單層備用。取經上述2.4步驟處理的培養3 h、6 h的THP-1細胞，用calcein-AM進行標記，D-Hanks平衡液洗滌2次，采用RPMI- 1640培養液將細胞濃度調至5×108/L備用。用D-Hanks平衡液洗滌96孔板中鋪有EA.hy926細胞的培養孔2次，每孔加入0.2 mL的THP-1細胞，37 ℃孵育30 min，用D-Hanks平衡液小心沖洗掉未黏附的THP-1細胞。置于100倍熒光倒置顯微鏡下觀察，每組設6個復孔，每孔隨機選擇6個視野，取平均值計算黏附的THP-1細胞數目。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統計軟件處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 電燒傷大鼠血清VEGF和sFlt-1含量

大鼠電燒傷后6 h和24 h血清VEGF的水平較正常大鼠顯著增加(P<0.01), 血清sFlt-1的水平較正常大鼠明顯減少(P<0.01)，見表1。

表1 電燒傷大鼠血清VEGF和sFlt-1的含量

Table 1.VEGF and sFlt-1 concentrations in the serum of rats with electrical burns (Mean±SD.n= 6)

Group VEGF(ng/L)sFlt-1(μg/L)Normal 55.40±5.193.10±0.16Electricalburn(6h)85.80±6.69**2.50±0.16**Electricalburn(24h)164.20±10.61**1.20±0.02**

**P<0.01vsnormal.

2 THP-1細胞上清VEGF和sFlt-1的含量

電燒傷血清組培養3 h、6 h和24 h，THP-1細胞上清中的VEGF水平較正常對照組顯著增加(P<0.01)；細胞上清中sFlt-1的水平較正常對照組明顯減少(P<0.01)，見表2。

表2 電燒傷血清培養的THP-1細胞上清VEGF和sFlt-1的含量

Table 2.VEGF and sFlt-1 concentrations in supernatants of THP-1 cells cultured with electrical burn serum (Mean±SD.n=6)

Group VEGF(ng/L)sFlt-1(ng/L)Normalserum 129.90±5.02498.00±8.26Electrical3h193.30±7.20**455.90±6.66** burnserum6h274.40±6.36**432.20±5.27** 24h406.20±7.91**392.00±4.58**

**P<0.01vsnormal serum.

3 單核-內皮細胞黏附

與正常血清組比較，電燒傷血清組每100倍視野下與EA.hy926細胞黏附的THP-1細胞數均顯著增多(P<0.01)；而電燒傷血清+阻斷劑組每100倍視野下與EA.hy926細胞黏附的THP-1細胞數較電燒傷血清組明顯減少(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The effect of sFlt-1 on monocyte adhesion cultur with electrical burn serum (×100) . A, E: normal serum; B, F: normal serum+sFlt-1; C, G: electrical burn serum; D, H: electrical burn serum+sFlt-1. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal serum.

圖1 sFlt-1對電燒傷血清誘導單核-內皮細胞黏附作用的影響

討 論

VEGF是血管內皮細胞特異的有絲分裂素，其表達可受多個因素調節，其中，缺氧是最強的刺激因子[3]。VEGF可與血管內皮細胞上酪氨酸激酶受體(VEGFR1和VEGFR2)的細胞外結合域結合，進而發揮一系列生物學效應。不同受體各有其不同生物學作用，例如VEGFR1對單核和巨噬細胞的游走有正調節作用，而對VEGFR2的信號傳遞起著正(負)調控作用，可溶性VEGFR1(sFlt-1)具有與VEGFR細胞外結構域相似的結構，能與VEGF結合，阻斷VEGF信號轉導通路，是內源性直接靶向VEGF的阻斷劑[4-5]。

本研究首先觀察電燒傷后大鼠血清VEGF和sFlt-1的水平，結果顯示傷后6 h和24 h大鼠血清VEGF的含量較正常大鼠明顯增加，血清sFlt-1的含量反之下降。我們推測電燒傷后受傷肢體高度腫脹，組織間壓力增高，血管受壓導致局部組織缺血缺氧，可能是電燒傷后血清VEGF水平升高的重要原因；傷后sFlt-1的水平下降亦可是導致有生物活性的VEGF的釋放量增多的另一個重要因素。

電燒傷血清是電燒傷導致機體病理生理改變的綜合體液因素，含氧自由基、炎癥介質和多種細胞因子，是引發炎癥反應的重要因素。本研究體外實驗中，我們采用電燒傷血清培養人單核細胞株THP-1模擬體內微環境對單核細胞的影響，結果顯示，電燒傷血清組培養3 h、6 h、24 h THP-1細胞上清液中的VEGF含量隨培養時間逐漸增加且均明顯高于正常對照組；sFlt-1的變化則相反，其含量隨著培養時間的延長而逐漸減少。這一變化結果與傷后大鼠血清VEGF和sFlt-1的改變相同。以上結果提示，VEGF含量增加與sFlt-1的減少密切相關。

我們前期研究結果顯示，電燒傷血清可以促進單核-內皮細胞的黏附作用[6]。為了進一步證實單核細胞分泌VEGF參與了單核細胞與內皮細胞的相互作用，筆者采用sFlt-1與電燒傷血清共孵育THP-1細胞，電燒傷血清+sFlt-1組與電燒傷血清組比較，結果顯示sFlt-1可有效抑制單核-內皮細胞的相互作用，減少與內皮細胞黏附的單核細胞數。

綜上所述，本研究初步證實電燒傷早期單核細胞分泌VEGF可促進單核-內皮細胞的黏附作用，是血管炎癥反應的重要始動因素之一；阻斷VEGF生物學效應可有效抑制單核-內皮細胞的黏附作用，為電燒傷早期抗炎治療提供新的治療思路和靶點。

[1] 阮瓊芳，謝衛國，溫豐平. 血管內皮生長因子在電燒傷大鼠血清及創面組織中的表達變化[J]. 中華燒傷雜志，2012，28(6):423-427.

[2] 張 偉，謝衛國，趙超莉，等. 大鼠單側肢體高壓電擊傷模型的建立[J/CD]. 中華損傷與修復雜志：電子版，2008，3(4):426-432.

[3] Bates DO. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability[J]. Cardiovasc Res, 2010, 87(2):262-271.

[4] Kendall RL, Wang G, Thomas KA. Identification of a natural soluble form of the vascular endothelial growth factor receptor, FLT-1, and its heterodimerization with KDR[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 226(2):324-328.

[5] Barleon B, Sozzani S, Zhou D, et al. Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1[J]. Blood, 1996, 87(8):3336-3343.

[6] 阮瓊芳，趙超莉，葉子青，等. 電燒傷大鼠血清誘導單核-內皮細胞黏附中的作用[J]. 中華燒傷雜志，2014，30(3):237-242.

Effect of monocyte-secreted VEGF induced by electrical burn serum on monocyte-endothelial cell adhesion

RUAN Qiong-fang, ZHAO Chao-li, YE Zi-qing, XIE Qiong-hui, XIE Wei-guo

(InstitureofBurns,WuhanThirdHospitalandTongrenHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China.E-mail:wgxie@hotmail.com)

AIM: To observe the level of vascular endothelial growth factor (VEGF) secreted by monocytes cultured with electrical burn serum, and to explore the effect of VEGF on monocyte-endothelial cell adhesion. METHODS: The electrical burn serum of the rat was prepared. The normal serum from the rats without treating electric current was also collected for control. The contents of VEGF and its soluble receptor sFlt-1 in electrical burn group were determined by double-antibody sandwich ELISA. THP-1 cells were randomly divided into normal serum group and electrical burn serum group. The contents of VEGF and sFlt-1 in the culture supernatants were measured by double-antibody sandwich ELISA. THP-1 cells were also randomly divided into another 4 groups: normal serum group, electrical burn serum group, normal serum + inhibitor group and electrical burn serum + inhibitor group. THP-1 cells, which were incubated with the serum for 3 h and 6 h, were labeled with calcein-AM and then were added into the well with monolayer of endothelial cell line EA.hy926 to detect monocyte-endothelial cell adhesion. RESULTS: The levels of serum VEGF of the rats with electrical burns were significantly increased, the levels of serum sFlt-1 were significantly decreased as compared with the controls. The levels of VEGF secreted by THP-1 cells cultured with electrical burn serum were significantly increased, the levels of sFlt-1 were decreased correspondingly. Electrical burn serum enhanced monocyte- endothelial cell adhesion, sFlt-1 inhibited the adhesion between monocytes and endothelial cells. CONCLUSION: The monocytes exposed to the electrical burn serum secrete VEGF, which enhance the adhesion between monocytes and endothelial cells. Blockage of VEGF activity may effectively inhibit monocyte-endothelial cell adhesion.

Electrical burns; Monocytes; Endothelial cells; Adhesion

1000- 4718(2015)04- 0755- 04

2014- 11- 13

2014- 12- 15

武漢市衛計委臨床醫學科研項目(No. WX13A09); 武漢市科技局重點攻關項目(No. 20056007071)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.032

△通訊作者 Tel: 027-68894838; E-mail: wgxie@hotmail.com