血管生成素2在大鼠內毒性急性肺損傷中的作用與機制研究

鐘明媚 宣國平 李 詩 王 璠 張 琳

·基礎醫學·

血管生成素2在大鼠內毒性急性肺損傷中的作用與機制研究

鐘明媚 宣國平 李 詩 王 璠 張 琳

目的 探討血管生成素-2(Ang-2)在脂多糖(LPS)致大鼠急性肺損傷(ALI)時的表達及其機制。方法 48只清潔級SD大鼠隨機分為正常對照組、1 mg/kg LPS組、5 mg/kg LPS組和10 mg/kg LPS組，每組12只。LPS組尾靜脈注射不同劑量LPS復制ALI模型，對照組注射同等體積生理鹽水，留取肺組織標本，觀察肺濕/干重(W/D)比值、HE染色光鏡觀察肺組織標本病理改變并進行肺損傷評分，各組ELISA法檢測血漿中Ang-2與血管內皮生長因子(VEGF)的表達，Westernblot方法檢測肺組織中Ang-2的蛋白表達情況。結果 LPS注射進入大鼠尾靜脈6 h后，光鏡下可見肺組織內的炎性細胞浸潤，肺泡隔增寬，肺間質水腫和肺結構破壞等病理改變；LPS各組的肺損傷評分與W/D比值明顯高于對照組(P<0.05)；LPS不同劑量組血漿中Ang-2與VEGF的表達水平較對照組明顯增高(P<0.05)，血漿中Ang-2的表達與VEGF、肺損傷評分呈正相關(r=0.826,P<0.05;r=0.775,P<0.05);LPS不同劑量組與Ang-2蛋白的表達水平呈現劑量效應關系(P<0.05)。結論 Ang-2參與大鼠ALI的發病過程，且Ang-2水平增高與ALI嚴重程度有關。

血管生成素-2；急性肺損傷；脂多糖；血管內皮生長因子

膿毒癥引起的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是臨床常見危重癥，其病理特征表現為彌漫性肺泡及微血管內皮細胞損傷、肺水腫及肺不張等[1,2]，臨床上可表現為頑固性低氧血癥及難治性急性呼吸衰竭[3]。盡管隨著呼吸支持技術的不斷進步，病死率已有所下降，但仍高達40%左右[4]。 因此，進一步闡明ALI/ARDS的發病機制，尋找新的，尤其針對其發病機制的防治措施，是目前臨床急需解決的重要問題。

血管生成素(angiopoietin,Ang)是一組分泌型內皮細胞特異性生長因子，包括四個亞型：Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4。Ang-2主要由內皮細胞分泌，作用于內皮細胞含有免疫球蛋白和表皮生長因子同源結構域2的酪氨酸激酶(tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains 2,Tie-2)，其過表達可破壞血管形成，導致血管通透性增高，引起血管滲漏[5]。我們的臨床研究發現ARDS患者血漿中Ang-2水平升高是內皮細胞損傷和血管通透性增加的重要標志，Ang-2在ARDS的發生與發展中起著重要的作用，且對其預后判斷也具有重要的參考意義[6]。本研究旨在通過應用不同濃度大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所導致大鼠ALI模型，觀察Ang-2表達水平的變化及Ang-2的水平與ALI程度的相關性，探討Ang-2在ALI發生發展中的作用，為進一步闡明ALI的發病機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康清潔級成年雄性SD大鼠48只，體質量(200±20)g，由安徽醫科大學動物實驗中心提供。實驗前，大鼠被飼養在恒溫的環境中，自由飲水與進食。

LPS(E.coli O111：B4)購自美國Sigma 公司；Ang-2 和血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)酶聯免疫試劑盒購自上海鑫樂公司；Ang-2 抗體和內參βactin購于美國Abcam公司；手動玻璃勻漿機(寧波新芝科器研究所)；western blot電泳儀(164-5051型美國Bio-Rad公司)。

1.2 模型制備及分組 實驗大鼠隨機分為4組，分別為正常對照組(n=12)，1 mg/kg LPS組(n=12)，5 mg/kg LPS組(n=12)，10 mg/kg LPS組(n=12)。參照課題組先前研究[7]，采用尾靜脈注射LPS制作內毒素性ALI模型(不同劑量LPS生理鹽水稀釋至1 mL后進行注射)，正常對照組大鼠尾靜脈注射1 mL生理鹽水。

1.3 肺水含量檢測 通過計算肺組織的濕/干重(wet/dry，W/D)比值來反應肺組織的含水量。大鼠放血處死后，打開胸腔，左肺盡量放出肺血管內殘血，并用濾紙吸干表面的滲液和血跡，左肺組織稱量濕重；置真空干燥箱，80℃脫水72 h，至重量不再變化，烤干后的肺組織稱量干重。肺W/D比值表示肺組織含水量。

1.4 肺組織病理學檢查 取各實驗組大鼠，開胸后取右肺中葉，以4%多聚甲醛固定，酒精干燥，石蠟包埋，切成6 μm厚度的切片，經蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察肺組織的病理學變化。

將肺組織病理切片放置于光學顯微鏡下觀察，肺損傷評分遵循以下標準[8]：肺泡內充血；紅細胞滲出；肺泡腔內中性粒細胞滲出或集聚；肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4項指標，分別按照病變的嚴重程度評分0～4分(0:無病變或非常輕微;1:輕度;2:中度;3: 重度;4:極重度)。各項評定的分數之和則是ALI的肺損傷評分。

1.5 western blot檢測肺組織中Ang-2蛋白的表達 取右肺中葉，凍存于液氮中，以備日后勻漿。取肺組織100 mg放入勻漿器中，同時加入組織裂解液1 mL充分裂解15 min。4℃，12 000 r，離心15 min，留取上清液。然后進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，孵育一抗(Ang-2抗體，1 ∶1 000)4℃過夜。TBST漂洗后，與二抗HRP(辣根過氧化物酶標記抗體1 ∶5 000)結合，室溫下在搖床上孵育1 h。TBST再次漂洗后將顯影液加于PVDF膜上，暗室中顯影。

1.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血漿中Ang-2與VEGF的表達 采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測血漿中Ang-2與VEGF的的濃度。檢測步驟按照試劑盒說明書操作。如果樣本濃度超過了標準曲線的極值，將樣本稀釋后重新檢測。

2 結果

2.1 肺組織病理形態學變化 取注射LPS后6 h的大鼠肺組織病理切片,光鏡下觀察。正常對照組：肺泡結構清晰，肺泡隔未見增寬，肺泡壁薄，肺泡腔內未見出血及炎細胞滲出，見圖1。1 mg/kg LPS組：大鼠肺泡腔可見少量滲出和出血，肺泡隔輕度增厚，少量炎性細胞浸潤，見圖2。5 mg/kg LPS組：大鼠肺泡腔中可見中等量紅細胞滲出及炎性細胞浸潤，見圖3。10 mg/kg LPS組，肺內多量炎細胞浸潤，伴肺泡間隔明顯增厚，肺泡內大量紅細胞滲出以及肺間質水腫，肺組織原有形態結構嚴重破壞,見圖4。

2.2 肺組織W/D比值測定與肺損傷評分 正常對照組肺W/D比值為5.19±0.98，不同劑量LPS組大鼠W/D比值較正常對照組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，并且隨著LPS濃度的增高，W/D比值也隨之升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。遵循肺損傷評分標準進行肺組織病理肺損傷評分，不同劑量LPS組肺損傷評分較正常對照組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，并且隨LPS劑量的增加其肺損傷評分越高，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 對照組肺組織病理學變化(HE×400) 圖2 1 mg/kg LPS組肺組織病理學變化(HE×400)

圖3 5 mg/kg LPS組肺組織病理學變化(HE×400) 圖4 10 mg/kgLPS組肺組織病理學變化(HE×400)

表1 各組大鼠肺組織 W/D比值與肺損傷評分

注：與對照組比較,aP<0.05；與1 mg/kg LPS組比較,bP<0.05；與5 mg/kg LPS組比較,cP<0.05

2.3 血漿Ang-2與VEGF水平的變化 不同劑量LPS組血漿中Ang-2以及VEGF水平較正常對照組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，并且隨LPS劑量增加其表達水平升高，各組間差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血漿Ang-2與VEGF的變化

注：與對照組比較,aP<0.05；與1 mg/kg LPS組比較,bP<0.05；與5 mg/kg LPS組比較,cP<0.05

2.4 ALI大鼠Ang-2水平與VEGF、肺損傷評分的相關性 ALI大鼠血漿中Ang-2水平與VEGF、肺損傷評分均呈明顯的正相關性(r=0.826,P<0.05；r=0.775,P<0.05)，見圖5。

圖5 血清中Ang-2水平與VEGF(A)、肺損傷評分(B)相關性分析

2.5 western blot檢測肺組織中Ang-2的蛋白表達水平 提取肺組織中的蛋白，經SDS-PAGE電泳分離蛋白后，分別以β-actin和Ang-2抗體進行western blot分析，見圖6、表3。正常對照組大鼠肺組織存在微量的Ang-2蛋白表達，不同劑量LPS組肺組織Ang-2蛋白表達水平顯著高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著LPS劑量的增加其Ang-2蛋白表達豐度越高，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

內毒素性ALI是臨床常見危重癥，由肺內炎癥效應細胞(如中性粒細胞、單核巨噬細胞)介導肺微血管通透性增高、肺水腫是ALI的病理基礎[9]。由于ALI的發生有其自身特點，單純抑制生長因子(VEGF)或炎癥因子(白細胞介素等)并不能根本緩解ALI的呼吸功能損失，抑制血管滲漏將會成為ALI未來研究的重點[10,11]。

表3 各組肺組織中Ang-2蛋白表達相對灰度值

注：與對照組比較，aP<0.05；與1 mg/kg LPS組比較,bP<0.05；與5 mg/kg LPS組比較,cP<0.05

Ang及其相關受體Tie-2參與ALI的發病過程，Ang-2主要是由內皮細胞分泌而成，其過度表達可破壞血管生成，Ang-2與內皮細胞特異性受體Tie-2相結合，可導致血管通透性增高，引起血管滲漏。Ang-2是膿毒癥相關肺損傷時內皮屏障破壞的重要介質[12-14]，嚴重膿毒癥血循環Ang-2明顯增高，過度增高的Ang-2對肺高通透性具有重要病理作用，且Ang-2與疾病的嚴重程度以及ALI患者的死亡率增加密切相關[15,16]。

本研究在LPS尾靜脈注射成功制作的大鼠內毒素ALI模型的基礎之上，應用不同劑量的LPS(1、5、10 mg/kg)通過尾靜脈注射進入大鼠體內，結果表明，隨著LPS劑量的增加，大鼠ALI的程度越發加重，LPS組大鼠血漿中Ang-2比對照組顯著升高，并且隨著肺損傷程度的加重，Ang-2的表達水平也隨之升高，從而說明Ang-2參與了ALI的病理過程，且Ang-2含量升高可能是ALI嚴重程度的危險因素，血中Ang-2水平對ALI病情評價和預后具有重要價值。

VEGF是一種生長因子，又是一種通透因子，具有能夠促進肺微血管內皮細胞分裂增殖、誘導新生血管形成以及增加血管壁通透性的作用[17]，因此肺損傷時VEGF可表現出明顯的異常。本研究結果表明，不同劑量LPS組血漿中VEGF水平較正常對照組顯著升高，且肺損傷大鼠血漿中Ang-2水平與VEGF呈明顯的正相關性。Benest等[18]研究表明Ang-2-/-基因敲除小鼠可明顯減少VEGF、緩激肽、組胺等引起的血管滲漏，并提出Ang-2是多血管通透性誘導因子的關鍵以及核心因子。本研究結果亦提示Ang-2在ARDS血管滲漏中發揮著重要作用。

綜上所述，內毒素性大鼠ALI時肺組織Ang-2表達明顯增高，且與血清中VEGF、肺組織損傷評分密切相關，提示Ang-2導致膿毒癥大鼠肺組織通透性增加，從而可能最終導致肺組織的一系列病理生理的改變。因此Ang-2的研究為臨床防治ALI提供了新的治療靶點，對Ang-2導致肺毛細血管滲漏的確切機制值得進一步深入研究。

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(2015-05-08 收稿 2015-06-12 修回)

Effect of angiopoietin-2 on LPS-induced rat acute lung injury

ZhongMingmei,XuanGuoping,LiShi,etal

IntensiveCareUnit,theFirstpeople'sHospitalofHefei(theThirdAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity),Hefei230061,China

Objective To explore the expression and the potential effect of angiopoietin-2(Ang-2) in rats with acute lung injury(ALI). Methods Forty-eight male Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into four groups(n=12), which were normal control group, 1 mg/kg lipopolysaccharide (LPS) group, 5 mg/kg LPS group and 10 mg/kg LPS group. The ALI models were produced through venous injection of different doses of LPS, and the control group was injected with the same dose of saline. Lung samples were observed, lung wet and dry weight ratio (W/D), lung histopathology, and pathological score were detected. Plasma Ang-2 and vascular endothelial growth factor(VEGF) were assessed by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Protein was extracted from lung tissues for determination of Ang2 by Western blot analysis. Results After 6 h of LPS injected into the tail vein of the rats, the inflammatory cell infiltration, alveolar septum widened, the changes of pulmonary interstitial edema and pulmonary pathological damage were seen in lung tissues under the light microscope. The pathological score and W/D in LPS group were significantly higher than those in control group (P<0.05). The plasma levels of Ang-2 and VEGF were significantly increased compared with control group (P<0.05), and the plasma levels of Ang-2 were significantly positive correlated with VEGF levels (r=0.826,P<0.05) and pathological score (r=0.775,P<0.05). The expression of Ang-2 protein in different doses of LPS group was dose-dependent (P<0.05). Conclusion Ang-2 is involved in the pathogenesis of acute lung injury in rats, and the level of Ang-2 is positively correlated with the severity of acute lung injury.

Angiopoietin-2;Acute lung injury;Lipopolysaccharide;Vascular endothelial growth factor

安徽省自然科學基金(項目編號：1208085QH142)

230061 安徽省合肥市第一人民醫院(安徽醫科大學第三附屬醫院)重癥醫學科(鐘明媚,宣國平,李詩,張琳),醫務部(王璠)

張琳，2005202zhl@sina.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.09.001