杜氏鹽藻環盒子1相互作用蛋白的酵母雙雜交法篩選*

許 堯,張楠楠，張彥婷，李慶華，楊 露，朱相展，薛樂勛#，關方霞1,#

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫院 鄭州 450052

杜氏鹽藻環盒子1相互作用蛋白的酵母雙雜交法篩選*

許 堯1),張楠楠2)，張彥婷1)，李慶華1)，楊 露1)，朱相展1)，薛樂勛1)#，關方霞1,2)#

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫院 鄭州 450052

#通信作者：薛樂勛，男，1944年2月生，教授，研究方向：腫瘤標志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn;關方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物醫學前沿技術與應用，E-mail:guanfangxia@126.com

酵母雙雜交；杜氏鹽藻；誘餌載體；自激活；環盒子1

目的：構建杜氏鹽藻環盒子1(RBX1)的酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-RBX1，篩選與RBX1相互作用的蛋白。方法：采用PCR技術擴增杜氏鹽藻RBX1的開放閱讀框，測序分析后插入酵母表達質粒，構建誘餌載體pGBKT7-RBX1。將酶切鑒定正確的誘餌載體用PEG/LiAc法分別轉化到酵母菌Y187和AH109中，通過表型篩選檢測RBX1對酵母菌有無自激活和毒性作用。轉化誘餌質粒的Y187與文庫菌AH109雜交，待三葉草形狀的合子形成后用營養缺陷型培養基和α-半乳糖苷酶活性實驗篩選陽性克隆并測序。結果：成功構建了pGBKT7-RBX1，它對Y187和AH109兩種酵母菌既無自激活又無毒性作用。雜交后篩選得到兩個陽性克隆，陽性克隆1與萊茵衣藻和擬南芥中氧化還原酶鐵硫蛋白亞基的同源性為38%和39%，陽性克隆2與萊茵衣藻中轉化抑制劑蛋白的同源性為57%。結論：誘餌載體pGBKT7-RBX1可用于酵母雙雜交。成功篩選得到兩個陽性克隆，可能是與RBX1相互作用的蛋白。

泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system,UPS)是細胞內蛋白選擇性降解的重要途徑，其功能失調可促進腫瘤的發生、發展和轉移[1]。腫瘤發生時，泛素介導的蛋白質降解途徑在細胞周期紊亂、DNA損傷和細胞凋亡中起關鍵作用[2]。環盒子1(ring-box 1,RBX1)是SCF-E3泛素-蛋白連接酶復合體中的指環亞基，通過靶向降解不同的底物蛋白而發揮調節多種細胞生物學過程的作用[3-4]。RBX1存在于動植物的細胞質和細胞核中，進化上比較保守。人的RBX1包含一個環指-H2 的結構域，對鋅離子結合和泛素連接是必需的[5-6]。作為泛素連接酶 E3 的重要組成部分，RBX1在腫瘤發生時表達異常而無法產生調節作用，不能誘導腫瘤細胞衰老和凋亡，在腫瘤發生發展過程中起重要作用，但具體分子機制尚不清楚。腫瘤發生與纖毛異常密切相關。然而，在人類細胞中進行纖毛的研究比較困難，而杜氏鹽藻以其無細胞壁、有一對等長的鞭毛、生長周期短、培養條件簡單等獨特的優勢成為鞭毛研究的模式生物[7]。作者所在的實驗室前期研究發現RBX1可能參與了鞭毛的再生過程，為揭示RBX1的生物學功能及腫瘤的發生機制提供了新的視野。該實驗以杜氏鹽藻為模式生物，利用酵母雙雜交技術[8]，通過構建杜氏鹽藻RBX1酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-RBX1，分別轉化酵母菌株Y187和AH109并檢測其對酵母菌株有無自激活和毒性作用，轉化誘餌質粒的Y187與文庫菌AH109雜交，待三葉草形狀的合子形成后用α-半乳糖苷酶活性實驗和營養缺陷型培養基篩選陽性克隆并測序，尋找RBX1相互作用蛋白，并為研究其在杜氏鹽藻鞭毛再生中的功能做基礎性工作。

1 材料與方法

1.1 藻體、菌株和主要試劑 大腸桿菌DH5α系鄭州大學醫學實驗中心細胞生物學研究室保存；杜氏鹽藻藻株UTEX LB-1644購于美國得克薩斯州大學；杜氏鹽藻cDNA酵母文庫由作者所在的實驗室構建并保存；誘餌載體pGBKT7、酵母菌株Y187和AH109購于Clontech公司；pMD19-T simple、pUCm-T購于Sangon公司；誘餌載體pGEM-T Easy購于Promega公司；Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；YPDA液體和固體培養基以及DO Supplement系列酵母培養基均購于上海Genomics公司；X-gal、X-α-gal、DMSO均購自Sigma公司；PCR特異性引物由Sangon公司合成；EcoRⅠ、PstⅠ、T4 DNA連接酶、DNA Marker、AMV cDNA 第一鏈合成試劑盒均購于大連TaKaRa公司；質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；紫外分光光度儀購于美國Thermo公司；PCR儀購于Biometra公司；凝膠成像儀購于Synopticsltd公司；DYY-8C型電泳儀購于北京六一實驗儀器廠。

1.2 杜氏鹽藻RBX1開放閱讀框的擴增 根據pGBKT7載體上的多克隆位點和杜氏鹽藻RBX1 cDNA序列，設計上下游分別含有EcoRⅠ與PstⅠ位點的特異性引物。RBX1-ORF-F-S1:5’-GGAAT TCATGAGTGCTGCTGCTGAGG-3’(EcoRⅠ)；RBX1-ORF-R-S2:5’-AACTGCAGCTAGTCCAGCCCAACAGC C-3’(PstⅠ)。杜氏鹽藻總RNA的提取方法根據Trizol試劑說明書進行，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后檢測RNA的完整性和純度，然后根據AMV cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模版，PCR擴增RBX1開放閱讀框。PCR反應體系：上、下游引物(100 μmol/L)各1 μL，dNTP(10 nmol/L) 8 μL，LA Taq酶0.5 μL，模版cDNA 1 μL，10×LA PCR Buffer 10 μL，加ddH2O補至100 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 pMD19-T-RBX1的獲得與鑒定 PCR產物膠回收后的目的片段與克隆載體pMD19-T simple于4 ℃連接12 h，獲得載體pMD19-T-RBX1。將連接產物轉化到DH5α感受態細胞中，將菌液均勻涂布于LB固體培養基(含有氨芐青霉素、IPTG和X-gal)上進行藍白斑篩選，37 ℃恒溫培養箱中過夜培養。挑取白色飽滿的單克隆于LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養7～9 h后提取質粒，用EcoRⅠ與PstⅠ進行酶切鑒定，酶切鑒定正確后回收目的片段，同時將菌液送至測序公司測序。

1.4 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-RBX1的構建

將鑒定正確的pMD19-T-RBX1與誘餌載體pGBKT7用EcoRⅠ和PstⅠ分別過夜雙酶切，回收RBX1片段和pGBKT7片段，用T4 DNA連接酶連接(4 ℃連接12 h)并轉化至DH5α感受態細胞中，涂布于LB固體培養基(含有卡那霉素)上，37 ℃過夜培養后挑取白色飽滿的陽性克隆，提取質粒pGBKT7-RBX1，經雙酶切鑒定正確后送至測序公司測序。

1.5 誘餌載體pGBKT7-RBX1的轉化

1.5.1 酵母感受態細胞的制備 采用醋酸鋰法分別制備酵母Y187和AH109的感受態細胞，劃線于YPDA固體培養基至長出2 mm克隆后，挑取單克隆接種于3 mL YPDA液體培養基中，30 ℃、230～250 r/min恒溫搖床振蕩培養16～20 h至光密度值(OD)600 nm達到0.15～0.30，然后接種于50 mL YPDA液體培養基中，30 ℃、250 r/min恒溫搖床振蕩培養至OD600 nm達到0.40～0.50(約4 h)。室溫、2 500 r/min將菌液離心5 min，棄上清，加30 mL去離子水輕輕重懸沉淀，再次離心棄上清，用3 mL 1.1×TE/LiAc溶液重懸沉淀。將酵母細胞分裝于1.5 mL的EP管中，11 000 r/min離心20 s，棄上清，加600 μL 1.1×TE/LiAc溶液重懸細胞，所得細胞懸浮液即為酵母感受態細胞。

1.5.2 誘餌載體轉化酵母菌及陽性克隆的鑒定 在1.5 mL的EP管中加入50 μL酵母感受態細胞、500 μL PEG/LiAc溶液、0.5 μL pGBKT7-RBX1和5 μL鮭魚精DNA(10 g/L)，渦旋混勻。將EP管置于30 ℃水浴鍋中孵育30 min。向EP管中加入20 μL DMSO，混勻，42 ℃水浴15 min(每5 min渦旋1次)，然后迅速放冰上2 min。將混合液13 000 r/min離心15 s，棄上清，用1 mL YPDA液體培養基重懸沉淀，30 ℃溫浴90 min，13 000 r/min離心15 s，棄上清，用生理鹽水溶液重懸。將菌液均勻涂布于相應的SD/-Trp固體培養基上，30 ℃恒溫倒置培養2～4 d，直至長出單菌落。挑取直徑大于2 mm的單克隆進行菌落PCR，檢測誘餌載體是否成功轉入酵母菌中。

1.6 毒性鑒定 將含有pGBKT7-RBX1的Y187和AH109分別劃線于SD/-Trp固體培養基上，30 ℃恒溫倒置培養至長出白色單克隆，挑取單克隆分別接種于5 mL SD/-Trp液體培養基中，30 ℃、250 r/min恒溫振蕩培養16 h后測OD600 nm，若酵母OD600 nm低于0.8，說明誘餌蛋白對酵母菌株的生長有毒性作用，不適用于酵母雙雜交系統。

1.7 自激活檢測 將含有pGBKT7-RBX1和空載體pGBKT7的Y187和AH109分別劃線于營養缺陷型(SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal、SD/-Trp/-Ade/X-α-gal、SD/-Trp/-His/X-α-gal)固體培養基上，30 ℃恒溫倒置培養2～4 d后觀察酵母細胞的生長情況。若酵母菌能夠在SD/-Trp/-His/X-α-gal固體培養基上生長，則需要在酵母雙雜交過程中加入His抑制劑3-AT。若菌株能夠在SD/-Trp/-Ade/X-α-gal固體培養基上生長，則誘餌蛋白具有自激活作用，不適用于酵母雙雜交系統。

1.8 酵母雙雜交 取1 mL文庫菌(AH109)在冰上融化后與轉化pGBKT7-RBX1的Y187共同轉接于5 mL 2×YPDA/Kanr液體培養基中，30℃、30～50 r/min溫和旋轉孵育，22 h后取少量菌液進行鏡檢，觀察是否有三葉草形狀的合子形成。雜交后的菌液涂布在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade固體培養基上，30 ℃倒置培養6～8 d至克隆出現。挑取直徑大于2 mm的單克隆劃線于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal固體培養基上，轉接5代后，仍正常生長且為藍色克隆則認為是篩選得到的陽性克隆。挑取陽性克隆作為模板進行菌落PCR，擴增得到的片段膠回收后與pUCm-T載體連接，轉化DH5α，酶切鑒定，并將菌液送上海生工生物工程股份有限公司測序和進行同源性分析。

2 結果

2.1 杜氏鹽藻RBX1的擴增及鑒定 用引物S1和S2、以鹽藻cDNA為模板進行PCR擴增，產物大小約為400 bp(圖1)，測序證實為420 bp，與預期大小一致。膠回收后將目的片段連接到pMD19-T simple載體，pMD19-T-RBX1質粒經EcoRⅠ與PstⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(圖2)顯示，一條帶約為3 000 bp(為線性pMD19-T simple載體)，另一條帶約為420 bp(為插入的RBX1片段)；測序結果證實插入的RBX1沒有發生突變。

2.2 誘餌載體pGBKT7-RBX1的鑒定 pGBKT7-RBX1雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳(圖3)顯示為兩條帶，一條約為7 300 bp(為線性pGBKT7載體)，另一條約為420 bp(為插入的RBX1 cDNA片段)。對pGBKT7-RBX1進行測序，結果顯示RBX1片段已插入到pGBKT7載體的多克隆位點中，且序列正確，無有義突變，酵母雙雜交誘餌載體構建成功。

圖1 RBX1開放閱讀框的PCR結果

圖2 pMD19-T-RBX1質粒雙酶切

M：Marker；1：pMD19-T-RBX1；2：pMD19-T-RBX1經EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切。

圖3 pGBKT7-RBX1酶切鑒定結果

M：Marker；1：pGBKT7-RBX1；2：pGBKT7-RBX1經EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切。

2.3 pGBKT7-RBX1的轉化 用引物S1和S2對轉化后的酵母細胞進行菌落PCR，電泳結果(圖4)顯示產物大小約為400 bp，經測序證實產物大小為420 bp，與預期大小一致，說明誘餌載體pGBKT7-RBX1已經成功轉入到酵母細胞中。

圖4 pGBKT7-RBX1轉化酵母菌菌落PCR結果

M：Marker；1：pGBKT7-RBX1轉化Y187；2：pGBKT7-RBX1轉化AH109。

2.4 毒性鑒定及自激活檢測結果

2.4.1 誘餌蛋白的毒性檢測 將轉化pGBKT7-RBX1的Y187和AH109分別接種于SD/-Trp液體培養基16 h后，測得OD600 nm分別為1.156和1.149，說明誘餌蛋白RBX1對酵母菌均無毒性作用。

2.4.2 自激活檢測 將轉化誘餌載體和空載體的Y187和AH109分別劃線于各種營養缺陷型固體培養基上，培養結果(圖5)顯示：在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal培養基上可以長出白色單菌落；在SD/-Trp/-His/X-α-gal以及SD/-Trp/-Ade/X-α-gal培養基上酵母菌不能生長。說明所構建的誘餌載體pGBKT7-RBX1對酵母菌無自激活作用，可用于酵母雙雜交系統。

圖5 自激活實驗

2.5 酵母雙雜交結果

2.5.1 雙雜交配子形成檢測 誘餌菌Y187與文庫菌AH109雜交，振蕩培養22 h后，取少量菌液進行鏡檢，能夠觀察到大量的三葉草形狀的合子出現，說明酵母雙雜交成功，可以進行下一步的篩選。

2.5.2 酵母雙雜交陽性克隆的鑒定 雜交菌液在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal固體培養基上轉接5代后，仍有兩個菌落為藍色，即為篩選得到的陽性克隆(圖6)。對陽性克隆進行菌落PCR，分別得到約900和600 bp大小的片段(圖7)，兩者分別命名為陽性克隆1和陽性克隆2。經測序鑒定和同源性比對分析，陽性克隆1與萊茵衣藻和擬南芥中氧化還原酶鐵硫蛋白亞基同源性分別為38%和39%，陽性克隆2與萊茵衣藻中轉化抑制劑蛋白同源性為57%。

圖6 酵母雙雜交陽性克隆的篩選

圖7 陽性克隆菌落PCR擴增結果

3 討論

酵母雙雜交系統是將目的蛋白的cDNA序列克隆至含轉錄激活因子(例如GAL4)DNA結合結構域基因的酵母表達載體中,獲得融合誘餌表達載體,將待測cDNA文庫克隆至含轉錄激活結構域的表達載體中，二者共轉化酵母菌，通過對報告基因的表達分析，篩選目的蛋白的互作蛋白[9]。酵母雙雜交技術在應用過程中存在的主要問題是假陽性較多,即當兩個蛋白之間沒有發生相互作用時,報告基因也被激活。造成假陽性的原因主要是誘餌蛋白本身可以激活下游報告基因的轉錄，所以必須通過自激活驗證誘餌蛋白是否可用于酵母雙雜交實驗[10]。此外，在實驗過程中必須嚴格設置對照，運用營養缺陷型培養基篩選并連續傳代以增強篩選能力，從而盡量排除假陽性結果。

該研究成功構建了含有RBX1基因開放閱讀框的酵母誘餌載體pGBKT7-RBX1，并將誘餌載體分別轉入到酵母菌Y187和AH109中，毒性檢測結果顯示轉化誘餌載體的AH109和Y187培養后OD600 nm均大于0.8，說明RBX1對兩種酵母菌均無毒性作用。另外，為排除假陽性結果，該研究檢測了誘餌載體pGBKT7-RBX1的自激活作用，結果表明RBX1對AH109與Y187均無自激活作用，可以用于酵母雙雜交實驗。轉化誘餌載體的Y187與文庫菌AH109雜交，待三葉草形狀的合子形成后用營養缺陷型培養基和α-半乳糖苷酶活性實驗篩選陽性克隆并測序，成功篩選到兩個陽性克隆，經測序鑒定和同源性分析，陽性克隆1與萊茵衣藻和擬南芥中氧化還原酶鐵硫蛋白亞基同源性分別為38%和39%，陽性克隆2與萊茵衣藻中轉化抑制劑蛋白同源性為57%。

作者初步獲得了可能與RBX1相互作用的兩個蛋白，后續研究需要通過體外和體內實驗免疫共沉淀進一步驗證。

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(2014-07-28收稿 責任編輯李沛寰)

Screening of proteins that interact with RBX1 from Dunaliella salina using yeast two-hybrid system

XUYao1),ZHANGNannan2),ZHANGYanting1),LIQinghua1),YANGLu1),ZHUXiangzhan1)XUE Lexun1)#,GUANFangxia1,2)

1)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)TheFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

yeast two-hybrid;Dunaliella salina;bait vector;self-activation;ring-box 1

Aim: To screen the proteins that could interact with ring-box 1(RBX1) in Dunaliella salina, a bait vector pGBKT7-RBX1 for RBX1 from Dunaliella salina was constructed. Methods: As a model organism, the ORF of RBX1 from Dunaliella salina was obtained by PCR amplification and confirmed by sequencing, and then inserted into the yeast expression plasmid pGBKT7 to construct a recombinant bait vector pGBKT7-RBX1. After being identified by double digestion, the constructed bait vector was respectively transformed into the yeast strains Y187 and AH109 using PEG/LiAc method. Subsequently, the self-activation and toxicity were respectively examined by phenotype assay.Y187 transformed with bait vector was hybridized with AH109 transformed with the Dunaliella salina cDNA expression library.After the formation of the clover shaped zygote, positive clones were screened in auxotrophic medium by the active experiment of alpha galactosidase. Then the screened clones were sequenced. Results: The constructed bait vector of pGBKT7-RBX1 was successfully transformed into yeast strains Y187 and AH109. The expression products of the recombinant bait vector had no self-activation or toxic effects on neither Y187 nor AH109 strains. Sequence analysis on screened positive colonies showed that they were respectively homologous with ferredoxin thioredoxin reductase subunit from chlamydomonas reinhardtii and arabidopsis thaliana(38% and 39%) and translational inhibitor protein from chlamydomonas reinhardtii(51%).Conclusion: The bait vector pGBKT7-RBX1 could be used for yeast two-hybrid system, and two positive colonies were obtained.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.005

*國家自然科學基金資助項目 30700014;科技部國際科技合作基金資助項目 2007DFA01240

Q782